整合素β1在大鼠BMSCs軟骨分化過程中的實驗研究*

鄧 娟，左右清，王 念，胡熙苒，曾 禮

1.湘潭醫衛職業技術學院臨床學院，湖南 湘潭 411104；2.中南大學湘雅醫學院基礎醫學院，湖南 長沙 410013

創傷和關節炎等引起的關節軟骨缺損性癥狀給患者的生活質量帶來極大的影響，也是骨關節外科目前的難題［1-2］。軟骨組織主要成分是水、膠原與蛋白多糖等，其營養主要由周圍關節液或下面的骨基質擴散而來，其中無血管無神經無淋巴組織，則限制了軟骨再生［3-4］。種子細胞骨髓基質干細胞（bone marrow stem cells，BMSCs）取材方便，來源廣泛，且增殖能力強，具有多項分化潛能［5-6］。已有研究顯示，外源性誘導因子、物理刺激、仿生支架等技術已成功地將BMSCs誘導成軟骨細胞，表達軟骨表型或特異性軟骨標志［7-8］。本實驗旨在利用TGF-β3和抗整合素β1單克隆抗體，分別促進和抑制整合素的表達，研究和探討整合素β1在大鼠BMSCs誘導軟骨分化的過程中的作用及其機制，以期為臨床軟骨組織的修復和應用提供理論基礎和實驗依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

健康4 周齡SD 大鼠（180～200 g/只）由中南大學湘雅醫學院動物中心提供，實驗均在湘雅基礎醫學院實驗中心進行。L-DMEM 培養基（GIBCO，美國），胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）（Hyclone，美國），Dexamethasone 和VitaminC （Sigma，美國），TGF-β3（PEPROTECH，美國），FITC anti-rat CD29 及同型陰性對照和FITC anti-rat CD45 及同型陰性對照（Biolegend，美國），FITC anti-rat CD34 及同型陰性對照（北京博奧森），CD29 單克隆抗體（Biolegend，美國），Col-II 抗體（北京博奧森），IHC 試劑盒（武漢博士德），DAB 顯色試劑盒（Pierce，美國），甲苯胺藍染液（Sigma，美國），預染maker （#SM0671）（Fermentas，美國），變性凝膠電泳（SDS-PAGE）和半干轉印所用試劑（Sigma，美國）。

1.2 實驗分組

采用全骨髓培養法培養大鼠骨髓基質干細胞，傳至第三代首先進行流式細胞儀檢測細胞表面CD29、CD34、CD45 的表達情況，得出CD29 的陽性率達99.0%。實驗分三組，（1）對照組：以基礎培養液（L-DMEM+10%FBS+1%雙抗+3%谷氨酰胺）常規培養（5% CO2，37℃）7 d 和14 d。（2）誘導組：在基礎培養液中加入TGF-β3（40 ng/mL）、地塞米松（0.1 μmol/L）、胰島素（6.25 μg/mL）、維生素C（50 μg/mL）。培養條件及時間同上。（3）抑制組：在基礎培養液中加入anti-CD29 單克隆抗體（0.1 μg/mL）、地塞米松（0.1 μmol/L）、胰島素（6.25 μg/mL）、維生素C（50 μg/mL），培養條件及時間同上。

1.3 col-Ⅱ免疫細胞化學染色

分別取誘導7 d 和誘導14 d 的細胞，每組隨機抽取2盒。PBS 清洗，甲醛固定，H2O2+純甲醇浸泡以滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水洗1～2次，BSA封閉液。滴加一抗（col-Ⅱ），37℃孵育1 h，PBS 清洗。滴加生物素化山羊抗鼠lgG，20～37℃孵育20 min，PBS清洗。滴加試劑SABC，20～37℃孵育20 min，PBS 清洗。DAB 顯色，蘇木素輕度復染，依次75%，95%，95%，100%，100%酒精各5 min脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察結果。

1.4 蛋白多糖甲苯胺藍染色

取誘導14 d 的細胞，每組隨機抽取2 盒。PBS 清洗，10%中性甲醛固定，PBS 清洗，加甲苯胺藍染液（注意加前要把染液過濾，以去除雜質），50 ℃下20～30 min，或者常溫下2～4 h。蒸餾水洗2次，把爬片固定在載玻片上。95%酒精分色10 s。PBS 洗2 次，封片，然后顯微鏡下觀察。

1.5 Western Blot檢測col-Ⅱ和integrin的表達

取誘導14 d 的細胞，每組隨機抽取2 盒。步驟分四步，（1）提取細胞蛋白（冰上操作）：用預冷的PBS 洗滌，加入細胞裂解液裂解20 min，刮取轉移至1.5 mL Ep 管，靜置、渦旋，使充分混勻，高速低溫離心機離心，4 ℃下14 000 轉/分離心10 min。取上清液并定量取5 μL 按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作，在酶標儀上進行蛋白濃度定量。煮樣，-20℃保存。（2）SDS-PAGE 電泳：分別配置好分離膠與濃縮膠，蛋白樣品按每孔60 μg 上樣，電泳槽置于冰盆中（4℃環境），電壓30 伏，待蛋白跑出孔，約30 min，調電壓60 伏，待蛋白跑進分離膠，約1～2 h。調電壓120 伏，電泳1.5～2 h。（3）半干式轉印：在轉膜槽底部陽極的平板上從下往上依次放置濾紙（三張）-PVDF膜-凝膠-濾紙（三張），以橫流轉印25～30 min。（4）免疫顯色：轉印完畢后室溫下封閉2 h。將PVDF膜與一抗（兔抗鼠col-Ⅱ，兔抗鼠integinβ1）在4 ℃下孵育過夜，TBST洗膜3次，再與辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次，進行ECL 顯色，在暗室中操作，再采用Bio-1D 凝膠成像系統掃描顯影的膠片，并用BioCapt 圖像分析系統進行定量分析（以平均光密度值Density 表示）。

2 結果

2.1 免疫細胞化學檢測col-II的表達

在TGF-β3的作用下，誘導組II 型膠原免疫細胞化學結果顯示有部分細胞呈陽性；誘導7 d，可見有軟骨細胞分化趨勢；誘導14 d，可見多數細胞形態由原來的長形向寬大扁平多角形變化；對照組與抑制組型膠原表達則為陰性，細胞仍為長形或長梭形，見圖1。

圖1 免疫細胞化學檢測col-II的表達

2.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達

取誘導14 d 的細胞進行甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖，可見誘導組的大部分細胞甲苯胺藍異染性著色明顯，蛋白多糖表達陽性，見圖2，左圖為×100，右圖為×200。

圖2 甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達

2.3 Western Blot檢測col-II蛋白和integrin的表達

誘導組細胞integrin 的表達量均較抑制組、對照組增多，差異有統計學意義（P＜0.01），說明細胞膜上的整合素受體被明顯下調，TGF-β3提高了整合素受體的表達量，見圖3。誘導組col-II 的表達量顯著高于抑制組和對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）；對照組和抑制組col-II 的表達量則無明顯差異，差異無統計學意義（P＞0.05），見圖4。

圖3 Western Blot 檢測integrin的表達

圖4 Western Blot 檢測col-II的表達

3 討論

多種原因導致的軟骨損傷是臨床常見疾病，但軟骨組織缺乏神經支配，痛感遲鈍，致延誤病情，缺乏血管、淋巴，致軟骨再生能力差，故易導致損傷進行性加重［9］，隨著組織工程技術和干細胞研究的不斷深入，誘導BMSCs分化為軟骨細胞視為目前軟骨再生修復的主要方法［10］，誘導因子在BMSCs定向軟骨分化過程中發揮著重要作用。

整合素是一個受體大家族，由α和β兩個亞單位組成，目前已經發現有18 個α 亞基和8 個β 亞基，相互之間以非共價鍵結合，可以形成24 種有功能的異二聚體跨膜糖蛋白［11］，分胞膜外區、胞漿區和跨膜區三部分。細胞外區能結合細胞外基質蛋白，而胞漿區與細胞骨架相互作用介導細胞形態和信號轉導。在BMSCs表面表達的主要整合素受體有β1、α1β1、αvβ3、α2、αL、β2、α5β1［12］，整合素介導的黏附作用調節著多種細胞功能，包括細胞分化與凋亡、細胞增殖、細胞黏附與遷移，淋巴細胞歸巢等［13］。整合素的調節受多種因子的影響，研究最多的是TGF-β、PDGF（血小板衍化生長因子）［14］，可以上調整合素的表達，而某些白細胞分泌的蛋白酶抑制物和細胞中抗腫瘤細胞增殖因子TNF（腫瘤壞死因子）、IL（白細胞介素）等以及抗整合素單克隆抗體［15］則可抑制其表達。有研究則表明：在體外用整合素抗體抑制肢芽間充質細胞表面整合素的表達可以抑制肢芽間充質細胞軟骨分化［16］。

TGF-β 與生長分化因子（GDF）、骨形態發生蛋白（BMP）均屬于TGF 家族，其中TGF-β、BMP 參與軟骨與骨的生成調節，而TGF-β 是體外軟骨分化的強誘導劑［17］。在人體內存在3種形式的TGF-β，分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，其中TGF-β3誘導成軟骨的作用最強，TGF-β2次之，TGF-β1相對最弱，其誘導生成的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達均比TGF-β1誘導時產生的量多且時間早。TGF-β3促進MSCs向軟骨方向分化，在5～40 ng/mL 范圍內具有時間濃度依賴性，隨著濃度增高和培養時間延長，Ⅱ型膠原的產生逐漸增多；大于40 ng/mL 時，無明顯增多甚至減少。本實驗采用40 ng/mL 濃度的TGF-β3來進行骨髓基質干細胞的軟骨方向誘導。

本研究用10%FBS（胎牛血清）的L-DMEM 培養液（40 ng/mL TGF-β3、地塞米松1×10 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL），抑制軟骨分化培養液（anti-CD29 單克隆抗體100 ng/mL、地塞米松1×10～7 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL），在單層培養條件下對大鼠骨髓基質干細胞進行誘導，誘導1 周時可見Ⅱ型膠原表達，2 周后進行甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達，提示有大量蛋白多糖的合成，免疫細胞化學檢測Ⅱ型膠原表達增多，且細胞形態由原來的長形或長梭形向扁平寬大多角方向變化，呈現軟骨細胞表型，抑制組和對照組檢查結果一致。通過Western Blot 實驗得到抑制組integrin 表達明顯少于誘導組，且幾乎不表達II 型膠原蛋白，與對照組結果相近，而誘導組能高表達integrin，同時II型膠原蛋白表達量亦明顯增多。結果表明anti-CD29 單克隆抗體能有效抑制integrin 表達水平，從而抑制軟骨形成，而TGF-β3能上調integrin的表達，促進軟骨分化。

綜合以上結果與分析，研究成功用TGF-β3誘導大鼠BMSCs 向軟骨細胞分化，表達軟骨細胞表型，也利用anti-CD29單克隆抗體抑制integrin表達，抑制了信號轉導，從而阻礙軟骨分化。研究明確了整合素通路可能是影響軟骨分化的重要信號傳導途徑，為修復軟骨缺損奠定了一定的理論基礎，但其具體機制還需要進一步的科學研究。