兔場魏氏梭菌病和兔瘟混合感染的研究

文│孫冬青（江蘇省睢寧縣姚集鎮綜合服務中心）

江蘇睢寧縣有養兔傳統，家兔養殖規模龐大。目前，影響養兔業發展的首要因素是疾病問題，如流行性腹脹腹瀉、傳染性鼻炎、球蟲病及兔瘟等，給養殖場戶造成了較大的經濟損失，且家兔疾病往往由多種病原體引起，臨床診斷難度較大，防治較為困難。

魏氏梭菌（Clostridium welchii）是一種兔腸道中常在的條件性病原菌。正常條件下，魏氏梭菌會與宿主處于一種動態平衡狀態，但當家兔抵抗力下降或飼養環境改變時該菌會大量繁殖，打破平衡狀態，并產生α毒素，導致家兔急性腹瀉、迅速死亡。兔病毒性出血癥（Rabbits viral haemorrhagic disease，RHD）又被稱為兔瘟，是由兔出血癥病毒（Rabbits haemorrhagic disease viral，RHDV）引起的一種家兔烈性傳染病，可導致家兔實質性器官出血、壞死，發病快，死亡率高。

由于這2種家兔傳染性疾病均可導致家兔大量死亡，在發病后若不及時治療會給兔場造成嚴重的經濟損失。2023年初，江蘇睢寧某兔場出現1月齡仔兔腹瀉、大量死亡的現象，通過對病死兔進行臨床問診、球蟲檢測、病理剖檢、致病菌分離、革蘭氏染色鏡檢及PCR凝膠電泳分子生物學鑒定，確診為魏氏梭菌病和兔瘟的混合感染，為臨床治療魏氏梭菌與兔瘟的混合感染提供科學參考。

一、材料與方法

1.樣品來源。江蘇睢寧某兔場1月齡病兔8只，發病兔臨床癥狀以腹瀉、斷續死亡為主。

2.試驗儀器與試劑。LB瓊脂培養基購自山東綠都生物科技有限公司。藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。Trizol試劑，Premix TaqTM（E×TaqTMVersion 2.0 plus dye）購自北京聚合美生物科技有限公司。溴化乙啶溶液購自上海澤葉生物科技有限公司。DM2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司。細菌基因組DNA小量提取試劑盒購自上海華舜生物技術有限公司。

主要儀器包括臺式冷凍高速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）、普通PcR儀（濟南光耀醫療設備有限公司）、凝膠成像系統（德國耶拿分析儀器股份有限公司）、電泳儀（北京市六一儀器廠）。

3.細菌分離純化與形態學檢測。使用接種環將病兔組織劃線接種于LB瓊脂培養基上。在37℃的恒溫培養箱中培養24小時，觀察細菌形態，選取疑似致病菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡下觀察細菌，鏡檢選取典型單一菌落再次進行純化培養。

4.球蟲病檢測。采用飽和食鹽水漂浮法對病兔糞便進行檢測，并在顯微鏡下使用麥克馬斯特計數板進行計數，確定每克糞便卵囊數量（Oocysts per gram，OPG）。

5.引物設計與合成。選取NCBI上發布的魏氏梭菌、RHDV和RHDV2的基因序列，引物序列見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。預擴增目的片段的大小分別為324、591和829bp。

表1 引物序列信息

6.PCR鑒定。

（1）細菌DNA的提取。細菌DNA的提取按照試劑盒說明書的具體步驟進行操作。

（2）病毒RNA的提取和反轉錄。取100毫克病兔肝組織，通過Trizol法提取組織中的RNA，按照兩步法RNA反轉錄試劑盒的步驟進行操作，將提取的RNA反轉錄為cDNA。

（3）細菌DNA的PCR鑒定。使用25微升的反應體系，Premix Taq酶加入12.5微升、無酶水加入9.5微升、上、下游引物各加入1微升，細菌DNA加入1微升。PCR反應條件：94℃變性4分鐘后進行循環；94℃30秒，54℃30秒，72℃1分鐘，共30個循環；72℃延伸10分鐘。

（4）病毒cDNA的PCR鑒定。使用6.3的反應體系。PCR反應條件：95℃預變性5分鐘；95℃變性30秒，51.1℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環；72℃延伸10分鐘。

7.藥敏試驗。按照WHO推薦的瓊脂紙片擴散法（K-B）對分離菌純化后進行試驗操作和結果判斷。抗生素紙片包括慶大霉素、青霉素、新霉素、頭孢氨芐、桿菌肽、恩諾沙星、卡那霉素、丁胺卡那、多黏菌素B、四環素、復方新諾明、阿奇霉素、環丙沙星、磺胺異噁唑、多西環素。

二、試驗結果

1.病理剖檢。臨床剖檢發現，病兔肛門周圍和后肢內側被毛沾染灰褐色糞便，有腥臭味（圖1A）。胃膨脹，胃內充滿未完全消化的飼料和乳汁，胃黏膜有大小不等的黑色斑點（圖1B）。脾呈紫黑色（圖1C），肝腫大，有散在的出血斑。心臟表面血管擴張，呈樹枝狀（圖1D）。小腸內充滿氣體，腸壁薄而透明（圖1E）。大腸內充滿氣體，腸漿膜及黏膜有彌漫性充血和出血斑，盲腸部分螺旋瓣內和結腸出現飼料板結現象（圖1F）。

圖1 病死兔剖檢

2.形態及培養特征觀察。由圖2可知，經細菌分離培養，從送檢兔脾、肝、肺、氣管、腎、盲腸等組織內分離得到4株病原菌，革蘭氏染色發現該菌為革蘭氏陽性桿菌，兩端鈍圓，有芽孢，菌體單個存在或鏈狀排列。

圖2 分離菌的形態、培養特性和革蘭氏染色觀察

3.球蟲病檢測結果。采集的兔糞樣品中均未查出球蟲，排除球蟲導致的腹瀉。

4.PCR檢測。取分離得到的DNA，應用PCR方法進行檢測，并用2%的瓊脂糖進行凝膠電泳。通過PCR擴增，在324bp位置出現魏氏梭菌特異性條帶（圖3）、在591bp位置出現RHDV特異性條帶，未檢測出RHDV2特異性條帶（圖4）。

圖3 細菌DNA凝膠電泳圖

圖4 病毒cDNA凝膠電泳圖

5.藥敏試驗。由表2可知，魏氏梭菌對四環素、多西環素、環丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、復方新諾明9種藥物敏感，對青霉素、桿菌肽、阿奇霉素、磺胺異噁唑4種藥物有較強耐藥性。

表2 藥敏試驗結果

三、討論

我國是世界上養兔最多的國家，近年來，隨著兔產業的快速發展，兔養殖業的規模化、集約化、現代化程度迅速提高，但家兔疫病防控面臨著新的困難和挑戰。家兔疾病往往由多種病原體引起，臨床診斷難度較大，防治較為困難。兔魏氏梭菌病又稱兔產氣莢膜梭菌病，是由A型產氣莢膜梭菌引起的一種兔消化道傳染病，具有較高的發病率和死亡率，無季節特異性和年齡特異性，所有年齡段的兔子在全年均可發病，但在冬春季節發病率較高，是威脅養兔業的重要傳染病之一。魏氏梭菌為革蘭氏陽性桿菌，是一種條件性致病菌，正常條件下在兔腸道中也有分布，與宿主處于一種動態平衡的狀態，但當外界改變時會引起宿主消化道內菌群紊亂從而導致發病，且常與其他致病性微生物混合感染，增加了診治難度。

兔病毒性出血癥又稱兔瘟，是由兔出血癥病毒引起的一種烈性傳染病，以實質性器官出血為主要特征，一年四季均可發病，發病急、傳播快，死亡率高。2010年，法國首次報道了RHDV毒株的新變種，并將其命名為RHDV2，2020年4月，我國四川省首次確診了RHDV2感染病例。隨后在河南和其他地方陸續出現相關報道，相較于經典RHDV，RHDV2感染的宿主范圍更廣，有逐漸取代經典RHDV的趨勢。近3年來，不論疫苗生產企業還是兔養殖戶的防控重點都聚焦在RHDV2感染，忽略了對經典RHDV感染的免疫防控，導致部分地區RHDV感染出現反彈。RHDV感染家兔出現慢性化、非典型化的特點，臨床癥狀主要表現為精神沉郁，與其他疾病混合感染，漸進性死亡。本次發病兔脾腫大呈藍紫色，肝明顯腫大有出血點，未見兔瘟的典型病理變化，臨床癥狀主要表現為腹瀉，剖檢顯示胃壁有多處潰瘍斑，小腸臌氣和盲腸內飼料板結。病兔內臟器官分離的細菌經染色、鏡檢及PCR鑒定確定為魏氏梭菌感染，同時PCR檢測顯示，兔肝組織RHDV弱陽性。但RHDV主要感染青年兔和成年兔，一月齡幼兔為不易感兔群，此次試驗檢測出RHDV弱陽性，可能與母兔RHDV疫苗免疫有關，或幼兔雖然感染RHDV，但由于年齡原因并未發病。幼兔在感染兔瘟后盡管未發病，但免疫系統會受到影響，使兔機體抵抗力下降，而魏氏梭菌是一種機會致病菌，會在家兔出現應激或自身抵抗力下降時大量繁殖，產生毒素，導致家兔死亡。據此判斷，雖然檢測出RHDV弱陽性，但兔的死亡原因主要是由魏氏梭菌大量增殖感染引起。

目前，針對魏氏梭菌病的治療主要是依賴于抗菌藥物，但由于大規模使用抗生素，使不同地區的魏氏梭菌均具有了很強的耐藥性。根據李燕平等報道，兔源魏氏梭菌對四環素、泰樂菌素、磺胺嘧啶耐藥。研究發現，從湖南婁底地區部分兔場分離得到的12株致病性魏氏梭菌對環丙沙星、磺胺嘧啶、氟苯尼考、慶大霉素、大觀霉素、林可霉素、多粘菌素、強力霉素8種藥物耐藥。對山東分離出的魏氏梭菌進行了藥敏試驗，結果表明，菌株對慶大霉素、四環素、青霉素、氨芐西林、紅霉素和桿菌肽耐藥。在本試驗中，分離得到的魏氏梭菌對青霉素、桿菌肽、阿奇霉素、磺胺異噁唑4種藥物有較強耐藥性，對四環素、多西環素、環丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、多粘菌素B、頭孢氨芐、復方新諾明9種藥物敏感，與上述報道結果有一定差異，這可能是由于不同地區抗生素的使用情況有差異，同時發病兔場魏氏梭菌的亞型不同。目前針對RHDV有成熟的疫苗，養殖戶定期進行疫苗預防能很好防控該病。而針對RHDV2目前無國家批準文號的疫苗，暫無特效藥物進行治療，只能通過接種現有疫苗進行提前預防，同時做好環境消毒和生物安全，盡可能地阻斷傳播途徑。

藥敏試驗結果顯示，該病兔分離的魏氏梭菌對四環素、多西環素、環丙沙星、慶大霉素、卡那霉素、多黏菌素B、新霉素、頭孢氨芐等多種藥物敏感。該兔場可選擇1～2種敏感藥物進行預防和治療，并接種兔瘟疫苗。同時需要做到防控，對病死兔進行無害化處理并進行環境消毒。

當兔場發生疾病后，需要及時進行科學診斷，盡快確定治療方法。科學合理的實驗室檢測在臨床診斷過程中十分重要，可以準確診斷出病原菌的種類，農戶可根據診斷結果準確使用藥物對患病兔進行有效治療，可以提高養殖場的經濟效益，促進養兔業健康可持續發展。