檢測新生兒溶血標本NSE校正公式的建立*

常珊碧 張保榮 沈潔 蔣曼麗 王躍幫

(宿遷市第一人民醫院醫學檢驗科,江蘇 宿遷 223800)

新生兒缺氧缺血性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)是指圍生期各種原因導致的腦組織部分或完全缺氧、腦血流供應降低導致的新生兒大腦損傷。研究顯示,盡管圍生期診療技術明顯提高,HIE仍是全球新生兒發病和死亡的重要原因之一[1-2]。神經元特異性烯醇化酶(Neuron-specific enolase,NSE)是HIE的敏感標志物,是一種酸性蛋白酶,也是糖酵解作用的關鍵胞內酶,炎癥損傷細胞和腫瘤細胞由于增值周期加快,糖酵解作用增強,導致NSE大量釋放入血液,使血清中此酶含量增高[3-6]。NSE特異性存在于神經元、神經組織來源的腫瘤組織以及神經內分泌細胞中[7-8],血清中NSE的濃度對新生兒缺氧缺血性腦病、嗜鉻細胞瘤、神經母細胞瘤以及小細胞肺和急性淋巴細胞白血病等疾病的鑒別診斷、療效評估和預后等方面具有重要意義[9-11]。在血小板和紅細胞中有γ亞基的NSE同工酶,因此當標本溶血時,NSE同工酶釋放到胞外與血清NSE出現部分交叉免疫反應,使檢測結果偏高,影響報告的真實性和可靠性[12-13]。臨床上新生兒采血極其困難,血清標本經常有不同程度的溶血,故本研究通過建立新生兒溶血校正公式,以探討其診斷新生兒疾病的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2021年1—5月本院新生兒科出生的新生兒血清樣本50例,其中男性28例、女性22例,時間<24 h。同時回顧性分析2021年1—5月出生的237例新生兒黃疸指數(Icterus)以及溶血指數(Haemolysis),患兒家屬均同意并簽署同意書,本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 佑科752N紫外可見分光光度計購自上海佑科儀器儀表有限公司;ROCHE E602全自動化學發光免疫分析儀及NSE配套原裝試劑(批號:52370301)購自瑞士羅氏公司;Sysmex XN-9000全自動血液分析儀及配套試劑、SLS溶血劑(批號:A1004)購自日本Sysmex公司,T5D低溫水平離心機購自上海盧湘儀公司;氰化高鐵血紅蛋白(cyanmethemoglobin , HiCN)標準液和文齊氏液均購自上海信帆生物科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準曲線的建立 采用佑科752N紫外可見分光光度計分別測定 50、100、150、200、250 g/L Hb標準液在540 nm處的吸光度值(用A表示),以吸光度為橫坐標,Hb濃度為縱坐標,制作標準曲線。將5份新鮮的全血樣本加到干燥潔凈的試管內,輕輕搖勻后,用Eppendorf微量移液器吸取20 μL混合全血加到含有5 mL文齊氏液的試管中中,輕輕搖勻,5 min后測定OD值,通過標準可得到血紅蛋白濃度。用0.9%生理鹽水將混合全血分別稀釋成Hb濃度為的20、10、5、2.5、1.25、0.625 g/L的樣本。分別吸取100 μL上述樣本加入到含有2.5 mL文齊氏液的試管中并搖勻,5 min測定540 nm處的吸光度值(A),以吸光度值為橫坐標, Hb濃度為縱坐標,繪制血清Hb標準曲線。

1.3.2 血清NSE結果檢測 選取當日檢測的新生兒全血新鮮樣本,3500 rpm離心10 min ,分離血清,用移液器吸取下層紅細胞300 μL于冷凍管內,將冷凍管在-80 ℃冰箱內,放置20 min,取出室溫平衡30 min至完全溶解,重復上述步驟5次。選取當日檢測的含有分離膠的血樣,用Eppendorf移液器吸取血清200 μL加入到干凈的試管內,加入5 μL上述紅細胞,充分混勻后3500 rpm離心10 min,分離血清,用于檢測NSE濃度。

1.3.3 血清Hb濃度測定 用Eppendorf移液器分別吸取上述血清100 μL和文齊氏液2.5 mL至一潔凈的試管內,輕輕搖勻,5 min 內測定540 nm處的吸光度(A)值,根據血清 Hb標準曲線計算出Hb濃度。

1.3.4 NSE檢測方法的相關性 按照美國臨床實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)的文件EP9-A2要求,對采用HiCN法和XN-9000全自動血液分析儀(儀器法)建立的校正公式,評價兩者之間的相關性。

2 結果

2.1 一般結果 <24 h出生的新生兒血清TB濃度為(137.00±56.84) μmol/L,25.3%(60/237)血液樣本均存在不同程度的溶血,溶血程度+/++/+++/++++分別占6.75/8.02/8.44/2.11%,其中血清中Hb>2 g/L占 9.28% (22/237)。

2.2 Hb標準曲線的建立 全血樣本Hb濃度的標準曲線為Hb全=328.73×A540nm+1.67(r2=0.996),血清樣本Hb濃度的標準曲線為Hb血清=35.56×A540nm+0.14 (r2=0.998)。見圖1。

圖1 血紅蛋白標準曲線

2.3 Hb與NSE的相關性 分別檢測50份新生兒樣本,測定其血清中NSE濃度,添加反復凍融紅細胞后,離心分離血清后繼續檢測其濃度,通過計算兩者血清NSE濃度變化與Hb濃度變化的比值,得出的NSE/Hb為(35.62±2.17) μg/g即血紅蛋白每增加1 g/L,NSE增加(35.62±2.17)ng/mL。以NSE血清為Y軸, Hb為X軸, NSE血清結果與Hb變化高度相關,其回歸方程分別為YΔNSE=32.90×Hb全血濃度+1.58(r2=0.991,P<0.001),YΔNSE=30.97×HbHICN+1.11(r2=0.981,P<0.001),見圖2。且兩者方法 NSE之間高度相關 (r2=0.933,P<0.01)。見圖3。

圖2 血清NSE與血紅蛋白濃度變化相關性

圖3 血紅蛋白儀器法和HICN法 NSE相關性

2.4 兩種校正公式與溶血前血清NSE比較 采用單因素方差分析對溶血前與矯正后3組數據進行分析,差異無統計學意義(F=0.136 ,P=0.873),見表1。50份樣本加入反復凍融的紅細胞后,NSE檢測結果(71.65±21.77)ng/mL,全部超過臨床參考區間,NSE校正=NSE溶血-ΔNSE,經上述兩種公式校正后,超過臨床參考區間的樣本分別為8份(16%)和7份(14%)。

表1 NSE校正公式相關性分析

2.5 校正公式的建立 根據ΔHb血清與ΔNSE的相關性,得出校正公式分別為:NSE校正=NSE測定-32.90×Hb全血濃度-1.58;NSE校正=ΔNSE測定-30.97×HbHICN-1.11。

3 討論

NSE在新生兒缺氧缺血性腦病、神經母細胞瘤、嗜鉻細胞瘤及小細胞肺癌等疾病中均有表達,在小細胞肺癌診斷和鑒別診斷中應用廣泛,具有較高敏感性和特異性[14-18]。同時NSE對腦細胞及血管損傷程度判斷有重要臨床價值,是腦損傷的特異性標志物[19-20]。溶血性標本中的血紅蛋白(Hb)濃度各不相同,血紅蛋白濃度越高對NSE的檢測結果影響越大,樣本在室溫放置時間的過久以及儲存溫度變化會導致樣本溶血從而使血清中NSE水平增高[21],王強等[22]研究發現血清中血紅蛋白每增加1 g/L,NSE檢測結果平均增加(23.70±3.62)ng/mL。

本實驗通過血清中加入不同濃度的Hb全血樣本,模擬溶血環境,通過檢測溶血后的NSE濃度,以評價不同濃度的Hb對NSE結果的影響。實驗結果顯示正常血清NSE濃度為(8.21±2.47)ng/mL,隨著溶血程度的增加,血清中Hb濃度也逐漸增高,導致血清中NSE的濃度也越來越高,ΔNSE值也越來越大。當標本發生輕微時Hb濃度為0.625 g/L,NSE的結果可增加16.54 ng/mL。當標本嚴重溶血時,如Hb濃度為10 g/L,NSE值增加的量高達325.49 ng/mL,明顯高于溶血前。經SPSS統計軟件分析,每克Hb含NSE的量呈正態分布(P=0.2634),每釋放1 g/L濃度的血紅蛋白,NSE濃度增加35.62±2.17(ng/mL),這與Mastroianni等[23]的研究結果一致。ΔNSE與ΔHb的直線回歸方程顯示, NSE與 Hb呈良好相關性(r2=0.998,r2=0.996,且P<0.001)。本實驗結果顯示,新生兒血清NSE檢測結果在未校正的情況下,大約有80%的新生兒結果可能被誤判,誤導新生兒治療。50份新生兒血清經兩種方法校正后,超過正常參考區間的樣本比例分別 16% 和14%,兩者與溶血前檢測結果差異無統計學意義(F=0.136,P=0.873),儀器法和HICN法高度相關(r2=0.933,P<0.001),本實驗得出的兩種NSE校正公式相關程度較高,但儀器法應用更加簡單方便。由于本實驗應用人工方法模擬溶血環境,得出的結果與血清中實際結果可能不一致。因此,對于新生兒樣本,無論應用哪一種校正公式,均需要在報告中標注提示臨床醫生,此結果僅作為參考,不是實測結果。

4 結論

新生兒樣本NSE檢測應當避免溶血,由于新生兒血管纖細,采血技術要求較高,容易導致新生兒樣本溶血,因此應用NSE校正公式能夠幫助臨床輔助診斷相關疾病,具有一定臨床價值。