314例初次獻血者Colton血型系統基因表型初步分析

李美霖,李琳琳,王 鵬,鐘思程,張燕華

(北京市通州區 中心血站,北京101100)

Colton血型系統(CO,ISBT 015)包含一個高頻等位基因和一個低頻等位基因,分別表現為Coa和Cob抗原[1-2]。第三個抗原Co3存在于除缺失型Co(a-b-)之外所有的細胞上。Colton抗體多為免疫抗體,因輸血或懷孕所誘發。抗-Coa抗體可導致嚴重的新生兒溶血病和遲發性溶血性輸血反應。抗-Cob抗體常與其他血型抗體形成補體結合型抗Cob,引起速發性和遲發性溶血性輸血反應[3-5]。本研究對314名初次獻血者Colton血型系統進行基因表型檢測,并對擴增產物進行測序。現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源在2019年9月至2020年5月,隨機選取本站采集的無血緣關系的314名初次獻血者EDTA-K2 抗凝全血標本5 ml。

1.2 試劑與儀器基因組DNA 提取試劑盒(杭州博日,批號:20190601),人類紅細胞血型Miltenburger,Diego,Colton,Yt(PCR-SSP法)(天津秀鵬,批號:191021001)。高速離心機(SIGMA1-14,美國SIGMA),渦旋混勻器(VDRTEX-5,其林貝爾),電泳儀和紫外分析儀(JY300C、JYO2S,北京君意東方),凝膠電泳槽(DYCP44P,北京六一),9700型PCR擴增儀(美國ABI)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 按照DNA提取試劑盒說明書的方法提取DNA。DNA使用濃度為30～100 ng/μL之間,最佳質量濃度30～50 ng/μL,A260/280純度比值1.6～1.8。

1.3.2PCR-SSP及測序 PCR-SSP及測序均按試劑盒說明書進行操作。Colton 血型基因型分型核苷酸突變點及引物序列見表1。內參質控為根據人類生長激素基因(HGH)的保守片段設計內參引物,存在于每個引物孔中,且在每次試驗中運行。PCR擴增反應程序如下:96℃預變性2 min;96℃變性20 s,68℃ 60 s,5個循環;96℃20 s,65℃ 45 s,72℃ 30 s,10個循環;96℃ 20 s,62℃ 45 s,72℃ 30 s,15個循環;72℃延伸3 min,4℃保溫。PCR產物經2.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像系統下檢測,記錄結果。對純化的擴增產物測序,與GenBank中的序列(ID:NG_007475.2)比對,分析結果。

表1 Colton 血型基因型分型核苷酸突變點及引物序列

1.3.3統計學分析 應用直接計數法計算基因頻率,某基因頻率=某基因的純合子頻率+1/2雜合子頻率;基因型頻率=AA基因型的個體數/該二倍體群體總數。采用χ2檢驗比較基因分布資料的觀察值與期望值,以P<0.05為差異有統計學意義,分析是否符合Hardy-Weinberg平衡法則。

2 結果

2.1 314名初次獻血者Colton血型系統基因分型及基因頻率篩選出Coa+b+表型2例、Coa+b-表型312例,未發現其他表型。2例Coa+b+表型中1例為歐洲人、1例為維吾爾族,漢族中未發現Cob。χ2檢驗顯示觀察值與期望值差異無統計學意義(P>0.05),符合Hardy-Weinberg分布,見表2。

表2 初次獻血者Colton血型系統基因分型及基因頻率

2.2 Coa+b+表型測序結果對2例表型為Coa+b+的樣本進行DNA 提取后,對編碼AQP1基因的外顯子1測序結果顯示,134位堿基均發生雜合突變(134 C>C/T),見圖1。

圖1 1例Coa+b+基因測序的部分結果

3 討論

Colton是一個相對簡單的稀有血型系統,位于aquaporin-1(AQP1),AQP1是一種紅細胞和腎細胞膜的結構蛋白,存在于腎、肺、血管內皮細胞、腦以及肝膽管、膀胱、眼。17kb的 AQP1基因包含4個外顯子,原位雜交方法將其定位于染色體7p14。Colton血型的多態性來自外顯子1上C134T的變化,是肽鏈第45位氨基酸不同所致,Coa及Cob為表現Ala45Val多樣性的對偶抗原。Coa在各種族都是高頻率抗原,白種人的分布頻率為99.7%。Cob在白種人的分布頻率為9.7%,在亞洲人群的頻率很低,在菲律賓、泰國等均未發現有Cob存在的報道[6]。Co3的位置未知,有Coa或Cob即會有Co3,Co3的分布幾乎為100%。

我國2008年開始建立中國人群稀有血型庫,針對Duffy、Kell、Kidd、MNS、Gerbich、Diego、Yt、Lutheran、Colton、Ok 以及ABO,Rh 血型系統中高頻抗原進行篩選[7]。截至目前Colton血型的報道很少,其中新疆維吾爾族Cob基因頻率為0.005 9[8]、塔吉克族為0.04[9]、回族為0.006 8[10],西藏藏族為0.002 4[11],浙江漢族和畬族[12]、成都地區獻血人群[13]等均未檢出Cob。本次314名獻血者中發現2例Cob+,均不是漢族。Cob頻率為0.006 7,除去1例外籍獻血者,Cob頻率為0.003 3。Colton 血型系統基因頻率可能因地域和民族存在差異,其他地區和民族的分布還有待進一步調查。

Colton 血型系統的檢測因稀有血清較難獲得,PCR 擴增技術則具有高靈敏度。每次實驗設置內參引物作為質控,因其存在于所有人類的DNA樣本中,PCR 擴增后在每個引物孔中穩定出現,可證明試驗結果有效。本實驗在PCR-SSP基因分型的基礎上,采用直接測序法對Coa+b+進行基因測序,結果比較可靠。因北京地區獻血者中外來人群占比較高,進一步擴大樣本量繼續對Colton 血型系統進行篩選,有助于了解我國各民族Colton 血型的分布特點,豐富中國紅細胞稀有血型庫。