棲冷克呂沃爾氏菌臨床株對碳青霉烯類耐藥的分子機制

馬艷輝,劉真真,馮漸燾,姜美妍,朱元祺,趙自云*

(1.青島大學附屬青島市中心醫院,青島市腫瘤醫院,山東 青島266042;2.青島大學附屬醫院,山東 青島266003)

克呂沃爾氏菌屬現歸類于腸桿菌目中的腸桿菌科,被認為是一種條件致病菌,通常存在于環境中,也存在于人的胃腸道[1-2]。該菌屬可引起從輕微到致命的感染,如菌血癥、膽管炎、腹瀉、新生兒腦膜炎、腹膜炎和肺炎[2],但關于人體感染克呂沃爾氏菌的報道較少。到目前為止,克呂沃爾氏菌屬(Kluyvera)包括抗壞血酸克呂沃爾氏菌(K.ascorbata)、棲冷克呂沃爾氏菌(K.cryocrescens)、居中克呂沃爾氏菌(K.intermedia)、佐治亞克呂沃爾氏菌(K.georgiana)和四川克呂沃爾氏菌(K.sichuanensis)五個種[2]。

位于棲冷克呂沃爾氏菌染色體上的blaKLUC-1基因于2001年由Decousser報道[3],它編碼屬于CTX-M型的超廣譜β-內酰胺酶KLUC-1。D類碳青霉烯酶基因blaOXA-181于2007年在印度被首次報道[4]。此后,blaOXA-181基因在英國、美國、丹麥和中國等國家被發現,并在腸桿菌科中的流行率呈上升趨勢[5]。另外,攜帶blaOXA-181基因的腸桿菌科細菌主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[5],但目前還未在克呂沃爾氏菌屬細菌中檢出該基因。因此,本文對首例同時攜帶qnrS1、blaKLUC-1和blaOXA-181基因的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株進行報道。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株對碳青霉烯類耐藥的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49于2022年分離自肺部感染住院患者的痰標本。沙門菌H9812、ATCC25922和ATCC 700603以及大腸埃希菌J53AziR分別作為S1核酸脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)的分子量標記、儀器的質控菌株以及質粒的液相接合受體菌,且這些菌株均為本實驗室保存。

1.2 儀器和試劑細菌鑒定通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS,布魯克,德國)。藥敏試驗為VITEK 2 Compact系統,結果判定依據CLSI-M100-2021[6]標準。上海復星NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶免疫層析卡(C,質控對照線;K,KPC;O,OXA-48;V,VIM;I,IMP和N,NDM型酶)。S1核酸酶切的脈沖場凝膠電泳(S1-PFGE)的電泳系統以及凝膠成像儀均為BIO-RAD公司。

1.3 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49的測序基于Illumina MiSeq(Illumina,USA)和Oxford Nanopore MinION(ONT,UK)平臺對PD49株進行測序。使用Unicycler軟件(v.0.4.1)重新組裝所有reads,經校正后,使用PlasmidFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/PlasmidFinder/)、ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)和ISfinder(https://www-is.biotoul.fr)等在線軟件分析該菌株的生物學信息。

1.4 液相接合試驗和S1-PFGE棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49與EscherichiacoliJ53AziR的液相接合以及與接合子的S1-PFGE的試驗,操作參照相關文獻進行[7];接合子的酶型檢測采用NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶免疫層析檢測卡,操作步驟按照試劑盒內說明書。

2 結果

2.1 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49的藥敏和碳青霉烯酶型篩檢結果

棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49對氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢唑林、厄他培南、亞胺培南和美羅培南耐藥,但對頭孢曲松、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦和氨曲南以及氨基糖苷類敏感。另外,對喹諾酮類呈現中介藥敏表型。藥敏結果見表1。此外,經NG-Test CARBA 5碳青霉烯酶卡檢測,該菌株在OXA-48型碳青霉烯酶處呈現陽性條帶,結果見圖1。

圖1 碳青霉烯酶卡檢測結果圖

表1 PD49株、接合子和E.coli J53AziR的藥敏結果

2.2 棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49的測序和生物信息學分析結果

基于Illumina MiSeq和Oxford Nanopore MinION測序平臺技術,獲得了PD49株的全基因組序列。

生物信息學分析顯示:①染色體(PD49-chr)的長度為4844 054 bp,攜帶有超廣譜β-內酰胺酶blaKLUC-1基因以及多個耐藥相關的外排泵基因,如acrA、acrB、TolC、mdtB、和mdtC等。②PD49株攜帶1個質粒(被命名為pPD49-OXA-181),攜帶D類碳青霉烯類耐藥基因blaOXA-181和喹諾酮類耐藥基因qnrS1,大小為51 479 bp。依據復制子類型,質粒pQD49-OXA-181屬于ColKP3/IncX3型雜合質粒。③與OXA-48相比(GenBank Accession Number KC354801.1),該OXA-181基因顯示了45個核苷酸替代,導致4個氨基酸差異(T104A,N110D,E168Q和S171A)。測序分析的詳細結果見表2。

表2 克呂沃爾氏菌臨床株PD49的生信分析結果

2.3 質粒的液相接合及接合子的驗證結果

PD49株作為供體菌與作為受體菌的E.coliJ53AziR的液相接合,獲得了接合子,命名為PD49-C株。然后,對接合子進行碳青霉烯酶檢測、藥敏試驗和S1核酸酶切的脈沖場凝膠電泳(同時對PD49和PD49-C株),以進一步驗證。結果顯示:①接合子PD49-C在OXA-48型碳青霉烯酶處也呈現陽性條帶。②與PD49株比較,接合子PD49-C除了對哌拉西林/他唑巴坦顯示敏感外,其他藥敏結果基本一致;然而,接合子PD49-C與E.coliJ53AziR比較,對厄他培南、亞胺培南和美羅培南的MIC值提高了4～8倍。PD49、接合子PD49-C和E.coliJ53AziR的藥敏比較見表1。③S1-PFGE顯示,PD49和接合子PD49-C都攜帶一個分子量大小相同的質粒,且與測序數據的質粒pPD49-OXA-181的大小相一致,結果見(S1-PFGE)圖2。以上結果表明,攜帶blaOXA-181基因是PD49對碳青霉烯類耐藥的機制。另外,攜帶blaOXA-181基因的pQD49-OXA-181質?？山浺合嘟雍蟼鬟f到E.coliJ53AziR,這提示該質粒具有經水平傳遞到其他不同種的腸桿菌科細菌的潛能,可能導致耐藥基因的播散和對碳青霉烯類耐藥率的上升。

圖2 S1核酸酶切的脈沖場凝膠電泳結果圖

3 討論

耐碳青霉烯類腸桿菌構成了全球緊迫的抗生素耐藥性威脅,因為它既能通過克隆播散,又能通過諸如質粒等移動遺傳元件介導將碳青霉烯酶基因水平轉移到其他細菌。OXA-181是最常見的OXA-48-like碳青霉烯酶之一,世界上許多國家都報道了產生OXA-181酶的腸桿菌,并且攜帶blaOXA-181基因的細菌主要是肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌[5],但尚未有克呂沃爾氏菌屬細菌攜帶該基因的報道。因此,本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49攜帶blaOXA-181基因屬于國內外首次報道。

廈門希瓦菌(Shewanellaxiamenensis)被認為blaOXA-181基因的祖先,其染色體遺傳結構與報道的ColE型攜帶blaOXA-181基因的質粒相似[8]。PD49株攜帶1個被命名為pPD49-OXA-181的質粒,大小為51 479 bp,且碳青霉烯酶基因blaOXA-181和喹諾酮類耐藥基因qnrS1都位于該質粒上,并可經液相接合試驗傳遞到E.coliJ53AziR,這與LIU的結果[9]類似。依據復制子,該質粒屬于ColKP3/IncX3雜合型。YU等[10]從NCBI RefSeq數據庫下載的35150個細菌質粒中鑒定出的81個blaOXA-181陽性質粒呈現多種類型,但主要由IncX3型質粒攜帶。然后,YU等又系統地比較了66個blaOXA-181陽性IncX3質粒的宿主菌株、質粒類型和遺傳背景,發現攜帶blaOXA-181的IncX3質粒大多為ColKP3/IncX3雜合質粒,每個質粒長度為51 kb,主要分布在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中。另外,大多數攜帶blaOXA-181的IncX3質粒來自人類和大多數IncX3質粒同時含有blaOXA-181和qnrS1基因[10],這與本文研究的pPD49-OXA-181質粒相同。另外,與blaOXA-48的序列相比較(GenBank Accession Number KC354801.1),本研究的質粒pPD49-OXA-181攜帶的blaOXA-181基因顯示了45個核苷酸替代,導致4個氨基酸差異(T104A,N110D,E168Q和S171A)。

本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49的染色體(PD49-chr)上攜帶有超廣譜β-內酰胺酶blaKLUC-1基因以及多個耐藥相關的外排泵基因,如acrA、acrB、TolC、mdtB、和mdtC等。

超廣譜β-內酰胺酶KLUC由blaKLUC基因編碼,屬于CTX-M型酶。迄今為止,blaKLUC基因有6個亞型(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/refgene#KLUC)。2001年,從棲冷克呂沃爾氏菌中發現一個位于染色體上命名為blaKLUC-1的新基因,編碼超廣譜β-內酰胺酶(ESBL),它與其他CTX-M成員具有77%～86%的相同氨基酸[3]。然而,blaKLUC-2基因編碼的KLUC-2是一種質粒介導的CTX-M家族ESBL,從陰溝腸桿菌中鑒定出來,與KLUC-1相比具有單一氨基酸差異(G115R)[11]。隨后,blaKLUC-3和blaKLUC-4基因(編碼超廣譜β-內酰胺酶KLUC-3和KLUC-4)也都被證明位于大腸埃希菌和陰溝腸桿菌攜帶的質粒上[12]。最近,LI 等[13]報道肺炎克雷伯菌臨床株攜帶blaKLUC-5基因,且該基因也位于質粒上。與之前發現的KLUC-1(G18S)和KLUC-3(G240D)相比,blaKLUC-5基因編碼的KLUC-5酶具有氨基酸替代。blaKLUC-6基因由Tanabe在日本的城市污水中分離的棲冷克呂沃爾氏菌6BC3中發現,于2022年提交了該基因的序列(GenBank Accession Number NG_148621.1)。以上研究和報道提示,blaKLUC基因可通過移動遺傳元件在菌株的染色體和質粒之間進行轉移。

對于喹諾酮(fluoroquinolones,FQ)耐藥的傳播,質粒介導的喹諾酮類耐藥(plasmid-mediated quinolone resistance,PMQR)基因起著主要作用。已知幾種PMQR基因(qnr,aac(6’)-lb-cr,qepA和oqxAB)與FQ易感性降低有關。特別是qnrS1被報道為來自食品、牲畜和人源的大腸埃希菌中可傳播的FQ抗性基因。另外,qnrS1基因常與廣譜β-內酰胺酶或其他抗菌藥物的耐藥基因共存在同一個質粒上,以便通過抗微生物的共選擇,使這些菌株能夠長期存在,這不僅提供了選擇優勢,而且促進了它們的傳播。此外,qnrS1基因的高度流行與攜帶該基因的質粒類型相關,如IncX型質粒最多見[14]。本研究的棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49攜帶的blaOXA-181和qnrS1共存于ColKP3/IncX3雜合型pPD49-OXA-181質粒上,這進一步提示了這兩個基因的傳播和流行都與IncX型質粒相關。

綜上所述,本研究表明棲冷克呂沃爾氏菌臨床株PD49對碳青霉烯類耐藥的分子機制與其攜帶blaOXA-181基因有關。另外,同時攜帶blaKLUC-1、blaOXA-181和qnrS1基因的克呂沃爾氏菌為國內外首次報道。此外,本研究結果有助于增強對攜帶blaOXA-181和qnrS1基因的IncX3質粒的遺傳多樣性和特征的理解,并進一步闡明了它們在獲得和傳播這兩個基因的腸桿菌中的作用。