間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體對2型糖尿病小鼠胰島功能和炎癥因子的影響

王振剛,付 塬,張聞達(dá),朱長吉,李柱虎

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室,吉林 延吉133002)

流行病學(xué)調(diào)查顯示我國糖尿病總患病人數(shù)為1.298億,患病率高達(dá)12.8%,且呈逐年上升趨勢[1]。在糖尿病患者中,2型糖尿病約占95%以上,并呈年輕化趨勢,給患者及其家庭帶來巨大的心理及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[2]。大量研究發(fā)現(xiàn),間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植能降低血糖,改善胰島β細(xì)胞功能,降低糖尿病各種并發(fā)癥發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[3-7]。MSCs主要通過旁分泌的方式發(fā)揮組織損傷的修復(fù)作用,其中外泌體是MSCs旁分泌的主要成分[8-11]。本研究通過誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型,探討多次輸注胎盤MSCs來源的外泌體對2型糖尿病小鼠的血糖水平、糖耐量水平、炎癥因子水平及胰島功能的影響,報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料取4周齡健康的雄性C57BL/6小鼠30只,體重約20 g,購自北京維通利華公司。主要試劑:鏈脲佐菌素和4%的多聚甲醛組織固定液購自北京索萊寶生物有限公司。DAPI染液購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。α-MEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自HyClone公司,無外泌體血清及外泌體提取試劑盒購自SBI公司。抗胰島素及抗胰高血糖素抗體分別購自武漢塞維爾生物科技有限公司。小鼠C-肽ELISA試劑盒和小鼠胰島素ELISA試劑盒均購自酶聯(lián)生物科技股份公司。Luminex試劑盒購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司。羅氏活力血糖儀及血糖試紙均購自羅氏血糖健康醫(yī)護(hù)公司。

1.2 胎盤MSCs外泌體的制備

采用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MSCs,待細(xì)胞融合度達(dá)到70%左右,更換含10%無外泌體血清的α-MEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后,收集細(xì)胞上清,然后采用SBI外泌體提取試劑盒提取外泌體。將獲得的外泌體沉淀懸浮在PBS緩沖液中,分裝并放于-80℃冰箱保存,備用。

1.3 外泌體的鑒定

使用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)觀察外泌體的形態(tài)。取10 μl外泌體滴加在無定形碳包覆銅網(wǎng)上沉淀5 min,吸去多余液體,晾干。滴加10 μl的1%磷鎢酸復(fù)染2 min,吸去多余液體,晾干。通過TEM觀察外泌體并照相。采用NanoSight納米顆粒跟蹤分析儀測定外泌體的粒徑分布范圍及濃度。取20 μl外泌體進(jìn)行50倍稀釋,然后進(jìn)行上機(jī)檢測。

1.4 模型建立及分組

從購買的30只小鼠中隨機(jī)取出24只作為造模組,剩余6只作為對照組。造模組進(jìn)行高脂高糖飲食喂養(yǎng)8周后,按40 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射鏈脲佐菌素溶液一次,連續(xù)注射5天。正常組小鼠正常飼養(yǎng)8周后,腹腔注射等劑量的PBS一次,連續(xù)注射5天。一周后開始檢測小鼠血糖,連續(xù)3天檢測隨機(jī)血糖大于等于13.9 mmol/L的小鼠被認(rèn)為糖尿病造模成功。將糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型組和外泌體治療組。模型組小鼠每隔一天尾靜脈注射100 μl PBS,外泌體治療組每隔一天尾靜脈注射20 μg外泌體,治療4周。治療結(jié)束后,再觀察2周,對小鼠行安樂死,收集胰腺組織和血清樣本。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1體重和血糖檢測 第一次靜脈注射外泌體后每周測定一次體重和隨機(jī)血糖,隨機(jī)血糖監(jiān)測均于上午9:00～10:00進(jìn)行。

1.5.2腹腔內(nèi)葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT) 外泌體治療4周后行腹腔注射葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)。小鼠禁食12 h,腹腔注射葡萄糖溶液(2.0 g/kg)。在注射后0、30、60、90和120 min分別測定血糖水平。

1.5.3酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 獲得全血后,室溫放置1 h 后,3 000 g 離心10 min,取上層血清檢測。根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測小鼠血清中C-肽和胰島素水平。

1.5.4Luminex多因子檢測 按照Luminex多因子檢測說明書檢測小鼠血清中的IL-1β、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ和TNF-α等炎癥因子水平。

1.6 胰腺組織HE染色及免疫熒光染色

4%的多聚甲醛固定組織48 h,常規(guī)石蠟包埋并制作石蠟切片,進(jìn)行HE染色并用光學(xué)顯微鏡觀察拍照。石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后,進(jìn)行抗原修復(fù),然后在1%BSA中封閉30 min。再將石蠟切片與抗小鼠胰島素抗體和抗小鼠胰高血糖素抗體在4℃下孵育過夜。次日,PBS洗滌3次后,加入稀釋好的熒光二抗避光孵育1 h。最后,使用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 MSCs外泌體的鑒定

采用外泌體試劑盒提取的MSCs外泌體通過透射電鏡可以觀察到膜結(jié)構(gòu)完整,為直徑小于200 nm的圓形囊泡(圖1A)。對獲得的MSCs外泌體進(jìn)行納米顆粒跟蹤分析,顯示其直徑小于200 nm(圖1B),符合外泌體的直徑范圍。

圖1 MSCs外泌體的形態(tài)和鑒定

2.2 MSCs外泌體治療后小鼠體重、血糖及糖耐量的變化

與模型組相比,MSCs外泌體治療組的小鼠消瘦狀態(tài)有所緩解(圖2A),隨機(jī)血糖明顯降低(圖2B)。IPGTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示任何時(shí)間點(diǎn) MSCs外泌體治療組血糖均明顯低于模型組(圖3)。

圖2 多次輸注MSCs外泌體對糖尿病小鼠隨機(jī)血糖和體重的影響(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001)

圖3 多次輸注MSCs外泌體對糖尿病小鼠糖耐量的影響(*表示P<0.05,***表示P<0.001)

2.3 MSCs外泌體治療后小鼠血清中C-肽和胰島素水平

與正常組相比,模型組的小鼠血清中C-肽水平和胰島素水平均明顯下降,與模型組相比MSCs外泌體治療,小鼠血清中C-肽水平和胰島素水平均明顯升高(P<0.001)。見圖4。

圖4 小鼠血清中C-肽(A)和胰島素水平(B)(***P<0.001)

2.4 MSCs外泌體治療后小鼠血清中炎癥因子水平

與正常組相比,模型組的小鼠血清中促炎癥因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α水平均明顯升高,抗炎因子IL-4和IL-10水平明顯降低。與模型組相比經(jīng)MSCs外泌體治療小鼠血清中促炎癥因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α水平均明顯降低(P<0.001),而抗炎因子IL-4和IL-10水平明顯升高(P<0.001)。見圖5。

圖5 小鼠血清中炎癥因子水平(***P<0.001)

2.5 MSCs外泌體治療后糖尿病小鼠胰腺組織HE染色及免疫熒光染色分析

HE染色及免疫熒光染色結(jié)果顯示,正常組的小鼠胰腺組織形態(tài)完整,胰島內(nèi)細(xì)胞排列整齊;模型組小鼠胰島明顯變小,胰島形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞排列紊亂,胰島數(shù)目明顯降低;與模型組相比,外泌體治療組小鼠胰島形態(tài)及大小得到明顯改善,胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰可見,結(jié)構(gòu)較完整(圖6,圖7),其胰島β細(xì)胞的數(shù)量及比例與模型組比較也顯著上升(圖8)。

圖6 各組小鼠胰腺HE染色圖(×400)

圖7 各組小鼠胰腺免疫熒光染色圖(× 200)

圖8 各組小鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量及比例比較

3 討論

研究證明,MSCs可以改善胰島β細(xì)胞的功能,抑制胰島β細(xì)胞凋亡,從而改善機(jī)體的高血糖狀態(tài)[4,12-14]。MSCs可以在體外分化為β細(xì)胞或胰島素產(chǎn)生細(xì)胞[15-17],但是HESS等[18]發(fā)現(xiàn)MSCs在體內(nèi)僅可以刺激胰島β細(xì)胞的增殖,卻不能轉(zhuǎn)分化為胰島β細(xì)胞。MSCs也可能通過旁分泌多種細(xì)胞因子、生長因子或者外泌體進(jìn)而改善胰島功能[19-20]。

本研究采用多次輸注MSCs外泌體的方式,探討外泌體對2型糖尿病的價(jià)值。從血糖的檢測數(shù)值、血清中C-肽、胰島素及炎癥因子水平以及病理分析不同實(shí)驗(yàn)組糖尿病小鼠胰腺組織的結(jié)果證明,經(jīng)尾靜脈多次輸注MSCs外泌體可有效降低血糖、增加對葡萄糖的耐受能力,且抑制體內(nèi)的炎癥反應(yīng),促進(jìn)胰島細(xì)胞分泌胰島素進(jìn)而發(fā)揮降糖的作用。MSCs外泌體治療組的小鼠,在輸注外泌體一周后,其血糖水平下降較為明顯,這可能與外泌體中含有大量的microRNA 有關(guān)。研究顯示,MSCs外泌體中的miR-let-7a-5p,miR-24-3P和miR-19-b-1-5p能夠提高胰島β細(xì)胞功能進(jìn)而促進(jìn)胰腺修復(fù)[21]。因此,多次輸注MSCs外泌體可以有效的降低血糖水平和抑制炎癥反應(yīng),從而對2型糖尿病小鼠有良好的治療作用。