載脂蛋白C1在腎透明細胞癌中表達及意義

張玉璽,崔萬里,孫熙武,付永濤,布占強,晉學飛,3*

(1.吉林大學中日聯誼醫院 泌尿外科二病區,吉林 長春130033;2.吉林省泌尿系統腫瘤分子診斷重點實驗室,吉林 長春130033;3.吉林省泌尿系統腫瘤重點實驗室,吉林 長春130033)

腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma,CCRCC)是腎癌中常見的一種病理類型,約占所有腎細胞癌的75%～80%[1-2]。目前研究認為CCRCC具有較高的侵襲性,且對于化療、放療的敏感性較差,導致其病死率也較高,預后較差,晚期CCRCC患者的5年總體生存率(overall survival,OS)約為10%,且對靶向治療不敏感[3-5]。載脂蛋白C1(apolipoprotein C1,APOC1)是載脂蛋白C家族的一員,其編碼基因位于19號染色體[6]。目前研究認為APOC1可以通過調節脂蛋白代謝相關的酶的活性,影響外周血脂蛋白的代謝[7]。新近研究發現APOC1與大腸癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等惡性腫瘤的發生及預后相關[8]。另外,KO等[9]研究發現APOC1在糖尿病腎病患者的腎小球組織中上調,并通過促進腎小球的硬化,促進糖尿病腎病的進展。本研究旨在通過生物信息學及體外實驗,觀察APOC1在CCRCC中的表達情況,及其與臨床病理學指標和預后的關系。

1 材料與方法

1.1 數據來源

從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數據庫中獲取CCRCC的腫瘤組織和正常組織的基因組數據和臨床病理學數據,分析APOC1在兩組之間的表達差異、與臨床病理學參數以及預后的關系。

1.2 細胞培養與轉染

786-O和UT33A細胞系均為CCRCC細胞系,HK-2細胞系為人腎皮質近曲小管上皮永生化細胞系,均購自ATCC。培養基為RPMI-1640,10%胎牛血清(FBS),100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素。細胞培養環境條件為37℃,5%濃度CO2。應用siRNA敲降細胞系中APOC1的表達,si-APOC1-#1序列:5’-TTTGGAAACACACTGGAGGA-3’,si-APOC1-#2序列:5’-AACTCATCAGCCGCATCAAA-3’,con-APOC1序列:5’-CGAACUCACUGGUCUGACC-3’,靶向APOC1過表達載體pcDNA3.1-APOC1均由上海吉凱生物技術有限公司設計合成。轉染試劑應用Lipofectamine 3000(Invitrogen,Carlsbad,CA),按照說明書進行操作。

1.3 RNA的提取及表達檢測

應用TRizol試劑提取細胞中總RNA。本次研究應用RT-qPCR方法檢測mRNA的表達。APOC1引物序列:正向引物5’-AGGACAAGGCTCGGGAACTCAT-3’,反向引物5’-GATGTCACCCTTCAGGTCCTCA-3’,選擇β-actin作為內參,引物序列:正向引物5’-GCAGGAGTATGACGAGTCCG-3’,反向引物5’-CGGACTCGTCATACTCCTGC-3’。基因相對定量采用2-△△Ct法計算。

1.4 蛋白表達測定

應用蛋白印跡法測定細胞中蛋白表達。應用含蛋白酶抑制劑的Ripa裂解液提取細胞中總蛋白,使用BCA試劑盒定量蛋白濃度。采用常規Western blot方法,用聚丙烯酰胺凝膠電泳法進行電泳,然后轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉封閉15 min,4 ℃下用一抗孵育過夜。次日用TBS-T將PVDF膜清洗3次,常溫下與二抗孵育1 h,再用TBS-T洗膜3次,用ECL顯影液顯影。相關抗體均購自Abcam公司。

1.5 細胞增殖能力測定

應用CCK-8法和集落形成法測定細胞增殖能力。CCK-8法:在96孔板中每孔鋪2×103個細胞,在0、24、48和72 h時,用CCK-8試劑盒分別檢測450nm激發波長的吸光光度值。集落形成法:在6孔板中每孔均勻種5×102個細胞,在培養箱中培養10 d,每3 d更換一次培養基,用4%多聚甲醛將細胞集落固定,0.1%結晶紫染料染色20 min,拍照并計集落形成數。

1.6 細胞遷移能力測定

應用Transwell法檢測細胞遷移能力。在Transwell板的上室中每孔加入1×105個細胞,并加入200 μl無血清培養基,下室加入500 μl含10%FBS的培養基。在培養箱中培養24 h,取出小室,擦除上室參與細胞,將下室細胞用4%多聚甲醛固定,0.1%結晶紫染料染色20 min,顯微鏡下選取5個互不重疊視野,計細胞數。

1.7 統計學方法

采用SPSS 25.0統計分析軟件對數據進行分析。應用t檢驗比較兩組之間的差異,多組之間的對比通過單向ANOVA方差分析和Dunnett進行評估。χ2檢驗用于評估基因表達與臨床特征之間的相關性。當P<0.05時,差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 APOC1在CCRCC組織中的表達情況

在TCGA數據庫中,共有532例CCRCC組織樣本和72例癌旁組織樣本的基因表達數據。APOC1在CCRCC組織中的表達顯著高于癌旁正常組織(P<0.001),且在各個期別腫瘤組織中的表達均顯著高于癌旁正常組織(P<0.001)。qRT-PCR結果提示,CCRCC細胞系(786-O和UT33A)中APOC1的表達顯著高于HK-2細胞系(圖1)。

圖1 APOC1在CCRCC組織中的表達

2.2 APOC1的表達與臨床病理資料的關系

分析CCRCC腫瘤組織中APOC1的表達與臨床病理資料的關系,APOC1的表達與腫瘤分級、病理TNM分期、病理T分期、M分期相關(表1)。此外,根據APOC1表達中位數,將532例患者分為APOC1高、低表達兩組。APOC1高表達的患者,OS顯著低于APOC1低表達的患者,風險比(高表達組:低表達組)為1.428(圖2)。

表1 APOC1的表達與臨床病理資料的關系

圖2 APOC1的表達與OS的關系

2.3 敲降和過表達APOC1細胞株的構建

將si-APOC1#1、si-APOC1#2和con-APOC1轉染至786-O細胞,構建APOC1敲降細胞株,發現si-APOC1#1敲降效率更高,故使用該細胞株作為APOC1敲降細胞株,命名為786-O-APOC1-KD,將con-APOC1轉染細胞株命名為786-O-APOC1-CON。將靶向APOC1過表達的載體pcDNA3.1-APOC1轉染至UT33A細胞,構建APOC1過表達細胞株,命名為UT33A-APOC1-OE,空載體pc-DNA3.1轉染的UT33A細胞命名為UT33A-APOC1-vector。構建完成的細胞株用qRT-PCR和WB進行驗證(圖3)。

圖3 敲降和過表達APOC1細胞株的構建

2.4 APOC1的表達對CCRCC細胞生物學功能的影響CCK-8結果顯示,786-O-APOC1-KD細胞株增殖能力顯著低于786-O-APOC1-CON細胞,而UT33A-APOC1-OE細胞株增殖能力顯著高于UT33A-APOC1-vector。Transwell結果顯示,786-O-APOC1-KD細胞株遷移能力顯著低于786-O-APOC1-CON細胞,而UT33A-APOC1-OE細胞株遷移能力顯著高于UT33A-APOC1-vector(圖4)。

圖4 APOC1的表達對CCRCC細胞生物學功能的影響

2.5 APOC1的表達對上皮間質轉化的影響應用WB檢測786-O-APOC1-KD、786-O-APOC1-CON、UT33A-APOC1-OE和UT33A-APOC1-vector細胞株中上皮間質轉化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)通路相關蛋白的表達情況。發現786-O-APOC1-KD細胞株中E-cad水平顯著升高,而N-cad、Vimentin和Snail表達水平低于786-O-APOC1-CON。而在UT33A-APOC1-OE和UT33A-APOC1-vector細胞株中得到了相反的結果(圖5)。

圖5 APOC1的表達對上皮間質轉化的影響

3 討論

APOC1最初在脂質代謝相關疾病中被發現,隨后大量研究表明,其參與了諸如糖尿病、腎小球硬化、動脈粥樣硬化等多種疾病的發生和發展過程[10-11]。近年來,關于APOC1與腫瘤的關系的研究日益增多,其異常表達可能與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤預后相關[12-13],這些研究均表明APOC1高表達可能預示著較差的預后和較高的惡性程度。本研究結果顯示,CCRCC患者腫瘤組織中APOC1水平顯著升高,且與性別、腫瘤分級、病理TNM分期,病理T分期和M分期相關,并且APOC1高表達的患者預后更差。這提示APOC1可能是CCRCC診斷和治療的新興分子靶點。

一些體外研究證明APOC1可能參與了調節腫瘤細胞的生物學功能。SU等[14]研究發現降低前列腺癌細胞系中APOC1的表達,可以降低細胞的增殖速度,并在一定程度上可以促進腫瘤細胞的凋亡。TAKANO等[15]研究發現APOC1過表達,可能會使胰腺癌細胞的侵襲性增強。此外,APOC1還被證實可能作為乳腺癌的生物標志物之一,其體外研究也發現APOC1低表達的細胞,其增殖速度也較慢[16]。本研究發現APOC1在CCRCC中表達上調,通過構建APOC1敲降和過表達的CCRCC細胞株并進行體外功能實驗,發現APOC1的過表達可能增強CCRCC細胞的惡性生物學行為,而降低APOC1的表達可以得到相反的結果,這提示APOC1可能加劇了CCRCC的惡性生物學行為,并可能促進了CCRCC的進展。

EMT最初認為是在人類正常發育中起著較為關鍵的作用,在之后的研究中發現腫瘤進展和轉移過程也伴隨著腫瘤細胞發生EMT。當細胞發生EMT后,腫瘤細胞極性降低,遷移能力增強,并容易發生遠處轉移[17-18]。所以,抑制EMT過程,可能會降低腫瘤發生轉移或者復發的幾率,這也為以EMT為靶點治療腫瘤提供了理論依據。此次研究結果提示,APOC1的表達與CCRCC細胞的EMT過程呈正相關。E-鈣黏蛋白的表達降低或缺失是腫瘤發展過程中,腫瘤細胞發生EMT的關鍵步驟,其表達水平降低提示腫瘤細胞黏附連接能力降低,不穩定性增強,故更容易發生腫瘤細胞遷移。此次研究結果提示,APOC1過表達可能會誘導CCRCC細胞發生EMT,提高了腫瘤細胞的惡性程度,從而影響了患者的預后。

綜上,APOC1在CCRCC組織中表達上調,其可能通過促進CCRCC的EMT,影響腫瘤細胞表型及患者預后,APOC1可能是治療CCRCC的新靶點。