生長分化因子15 沉默抑制人肝癌HepG2增殖及遷移作用研究

艾郁蔥,閆光志

(吉林省腫瘤醫院 1.放療一科;2.結直腸胃腹部腫瘤外一科,吉林 長春130012)

肝細胞癌(HCC)是一種高死亡率的原發性肝癌,為全球第三大癌癥死亡原因,盡管手術切除、經導管動脈化療栓塞和射頻消融、肝移植及受體酪氨酸激酶抑制劑等手段的應用大大提高了肝癌患者生存率,但由于其復發率高,患者總5年生存率仍然很低[1-2]。闡明HCC發病機制,找到新的、有效的治療策略是目前亟待解決問題。生長分化因子15(GDF15)是 TGF-β 超家族的成員,其多肽分子由一個29個氨基酸信號肽、一個112個氨基酸的成熟蛋白和一個167個氨基酸的前肽組成[3]。研究表明,GDF15在多種腫瘤如肺腺癌、結直腸癌、宮頸癌中有較高表達,并通過自分泌和旁分泌作用激活TGF-β/Smad、蛋白激酶1/2(ERK1/2)通路和ErbB2/AKT1等信號通路調節腫瘤細胞的增殖和凋亡,促進癌癥的發展[4-5]。本研究擬通過用短發夾RNA(shRNA)構建人肝癌HepG2細胞GDF15穩定低表達細胞系(shGDF15),并檢測其增殖及遷移能力變化,為尋找HCC治療靶點提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝細胞癌細胞系HepG2購自北納創聯生物技術研究院;大腸桿菌DH5α、干擾載體購自廣州萊德盟生物科技有限公司;PLKO.1慢病毒載體購自上海吉凱基因化學技術有限公司;限制性內切酶 BglⅡ和 HindⅢ、DNA 連接酶購自TaKaRa公司;Transwell小室、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購自長春久欣生物科技有限公司;LipofectamineTM2000、DMEM培養基、胎牛血清(FBS)、TRIzol 裂解液購自Invitrogen 公司;兔抗人E-cadherin、Vimentin抗體購自Cell Signaling Technology公司;小鼠抗人GAPDH 抗體、GDF15抗體購自武漢博士德公司;二辛可寧酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物科技公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔 IgG 和辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠 IgG 購自北京中杉金橋公司;ECL發光液購自Millipore公司;其余均為國產進口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1細胞培養 HepG2用含10% FBS、1%青霉素/鏈霉素DMEM培養基于37℃、5% CO2的恒溫孵箱內培養,隔日換液,待細胞鋪滿培養皿底部90%左右時按1∶3傳代。

1.2.2GDF15 shRNA質粒構建及鑒定 用PLKO.1慢病毒載體構建并鑒定shGDF15表達載體。使用含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板篩選重組質粒。在提取和純化無內毒素重組質粒后,使用 LipofectamineTM2000將 PLKO.1-sh-GDF15 載體和 Lenti-Easy 包裝混合物共轉染到293T細胞中。然后,收集細胞上清液用于濃縮和純化。慢病毒滴度采用熒光計數法測定。將shGDF15載體轉染到添加了聚凝胺的HepG2細胞中。轉染后48 h,加入嘌呤霉素(2 mg/mL)進行抗性篩選,2 周后采用熒光顯微鏡觀察轉染效果。使用RT-qPCR和蛋白質印跡測量轉染效果。

1.2.3RT-qPCR檢測肝癌細胞GDF15 mRNA表達水平 將處于對數生長期的野生型HEPG2細胞及shGDF15轉染細胞準確計數后,以6×105/孔鋪于6孔板,待其完全貼壁后用無血清培養液繼續培養24 h后,按TRIzol說明書提取培養細胞總RNA用于逆轉錄。按逆轉錄體系為20 μL,含總RNA 1 μg,4×gDNA Erase-Out Mix 5 μL,42℃ 逆轉錄15 min,經85℃ 5 s滅活逆轉酶活性后用于qPCR。按試劑盒說明書進行qPCR,反應體系為20 μL,含cDNA模板2 μL,2×Q3 SYBR qPCR Master Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,經95 ℃預變性2 min,經95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,共 40個循環后,以GAPDH為內參,用2-ΔΔCT法計算GDF15 mRNA的相對表達量。qPCR引物序列如下: GDF15上游5′-CA-ACTTCCGTGTGCTTTGGG-3′,下游5′-CAACG-TCTCTGCCTTCCACT-3′;GAPDH上游5′-CCT-CGCCTTTGCCGATCC-3′,下游5′-CGTGCTCGA-TGGGGTACTTC-3′。

1.2.4Western blot法檢測 用Western blot法檢測HepG2細胞shGDF15轉染效果及GDF15低表達HepG2細胞E-cadherin和Vimentin相對表達量。按1.2.3所述接種并培養細胞,收集培養細胞總蛋白,BCA 法檢測蛋白濃度。通過SDS-PAGE分離蛋白,電泳結束后,進行PVDF轉膜;5%的脫脂奶粉 TBST 緩沖液室溫封閉1 h;加適當比例稀釋的一抗4℃孵育過夜;次日,TBST 洗膜10 min,共4次;加入HRP標記的山羊抗兔IgG (1∶10 000),室溫孵育1 h;TBST洗膜10 min,共4次;用ECL化學發光顯色后通過上海Tanon化學發光成像一體機拍照分析。所用一抗及稀釋比例:GDF15(1∶1 000)、E-cadherin抗體(1∶500)、Vimentin(1∶300)、GAPDH(1∶5 000)。

1.2.5CCK8法檢測細胞增殖活性影響 對生長狀態良好的GDF15低表達HEPG2細胞分別以5×103個/孔接種于96孔板,于接種24、48和96 h后用CCK8法檢測其增殖活力,以空載體轉染的HEPG2做為對照。

1.2.6劃痕實驗檢測 將細胞首先接種于6孔板中,待細胞匯合度達到>90%后,用200 μL無菌槍頭劃一橫線,PBS 洗滌3次,將培養基更換為無血清DMEM培養基,用倒置顯微鏡進行觀察、拍照。放回培養箱繼續培養24 h后,再次用同樣方法對相對位置進行觀察、拍照。選取5個視野進行測量、統計分析。

1.2.7Transwell實驗 用Transwell小室法檢測培養細胞的遷移情況。將HEPG2細胞饑餓24 h后,胰酶消化,制備細胞懸液,PBS洗1次,將細胞濃度調整至4×105個細胞加入Transwell上室中,下室中加入800 μL含10% FBS的DMEM培養基,37℃孵育。24 h后,用棉簽擦去上室內殘留的細胞,甲醛固定10 min,0.1%的結晶紫室溫孵育10 min,PBS清洗3遍,將小室底面朝上于顯微鏡下拍照,隨機選取5個視野進行計數,統計分析,重復上述實驗3次。

2 結果

2.1 GDF15低表達HEPG2細胞系的獲得與鑒定

用shHK2質粒轉染HEPG2細胞后經嘌呤霉素抗性篩選2周,熒光顯微鏡下觀察轉染效果超過90%,shGDF15組細胞GDF15 mRNA和蛋白表達水平明顯低于shNC組,見圖1。

圖1 GDF15敲低穩定細胞株 HEPG2 細胞的獲得與鑒定

2.2 GDF15低表達細胞增殖活力檢測結果

在培養24、48及96 h后,GDF15低表達細胞的增殖活力均明顯低于對照組,差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 細胞中各個時間點不同組別肝癌細胞的 OD570 nm相對值比較

2.3 GDF15低表達HEPG2遷移能力檢測結果

細胞劃痕實驗檢測結果顯示,shGDF15組細胞劃痕填充面積明顯低于對照組,見圖2A。Transwell細胞遷移實驗結果見圖2B,培養24 h后,shGDF15組細胞遷移細胞數量為正常組的50%(45.2%～66.7%)左右,明顯低于正常組細胞數量,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 敲低GDF15對HEPG2 細胞遷移的影響

2.4 GDF15低表達HEPG2 E-cadherin和Vimentin表達檢測結果

Western blot結果顯示,shGDF15細胞E-cadherin表達水平明顯增加,Vimentin 表達水平明顯降低,與正常對照組比較,差異有統計學意義(P<0.01),見圖3。

圖3 敲低GDF15對HEPG2 細胞EMT相關基因表達的影響

3 討論

增殖、遷移是腫瘤細胞的基本生物學性狀,與腫瘤生長及轉移能力高度相關,是評價腫瘤惡性程度的重要指標。上皮間質轉化(EMT)是癌細胞轉移的關鍵過程,是上皮細胞獲得間充質細胞表型的生物學過程。E-cadherin為一種跨膜糖蛋白,屬上皮細胞鈣離子依賴的黏附分子家族,是常用的上皮細胞標志物,與多種腫瘤細胞的浸潤和轉移相關。Vimentin屬于一種中間絲蛋白,在EMT過程中,腫瘤細胞Vimentin表達上調,是EMT的常用細胞標志物。腫瘤細胞增殖能力、遷移能力及EMT程度是評價腫瘤細胞惡性程度的重要指標[6]。本研究將shGDF15載體轉染到HEPG2肝癌細胞中,獲得了內源性GDF15轉錄及翻譯水平均降低的HEPG2穩轉細胞系。增殖活力檢測結果顯示,GDF15低表達穩轉細胞系增殖活力明顯下降,遷移能力顯著降低,同時,E-cadherin表達水平明顯增加而Vimentin表達水平明顯降低,表明抑制GDF15表達可抑制肝癌細胞惡性轉化。

研究表明,GDF15在器官損傷、缺氧、腫瘤等多種疾病狀態下表達增加,并通過調節細胞增殖、免疫反應、血管生成、浸潤和轉移促進癌癥發展[7-8]。近年來,GDF15在肝癌發生、發展及治療中的意義引起了學者的重視。LIU等[9]對412例肝臟疾病患者血清和組織GDF15檢測發現,HCC患者血清GDF15水平顯著高于健康受試者及HBV和HCV攜帶者,而且,HCC癌巢中GDF15表達水平顯著高于相應癌旁組織和正常肝臟,提示血清GDF15有作為HCC的生物標志物的價值。GDF15單克隆抗體可有效抑制小鼠原發肝癌腫瘤生長,降低Tregs在腫瘤浸潤淋巴細胞中的比例,提高CD3+T細胞中IFN-γ+T細胞比例,降低IL-10+T細胞比例,提高CD4+和CD8+T細胞活性,表明有效抑制GDF15高表達可能抑制腫瘤生長、逆轉腫瘤引發的免疫抑制作用[10]。本研究發現,內源性GDF15表達下降低后,肝癌細胞的增殖、遷移及表型轉化能力均顯著降低,靶向GDF15,抑制其表達及活性可能對HCC治療有利,當然GDF15在HCC發生發展中的具體機制尚需大量研究證實。