定喘湯治療呼吸道合胞病毒感染的毛細支氣管炎的代謝組學研究

朱紫微，崔振澤，單玉霞，遲磊

（大連市婦女兒童醫療中心（集團） 小兒呼吸科，遼寧 大連 116000）

呼吸道合胞病毒 （respiratory syncytial virus，RSV）是導致小兒毛細支氣管炎最常見的病毒［1-2］。中醫學將毛細支氣管炎稱為“暴喘”“馬牌風”，治療以祛痰止咳、宣肺平喘為主［3］。定喘湯出自《攝生眾妙方》，可用于治療咳嗽喘息等病癥［4-5］。中醫學注重疾病全身的發展過程，而代謝組學可動態、系統地反映機體狀態，因此，代謝組學常用于中醫藥療效和機制的研究［6-7］。本研究將代謝組學應用于定喘湯治療RSV感染的毛細支氣管炎的患兒中，探討RSV患兒與健康兒童的代謝差異以及定喘湯發揮療效的作用機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2016年9月至2017年2月于我院接受治療的30例RSV感染的毛細支氣管炎患兒作為研究對象 （毛細組），另選取同期于我院體檢的38例健康兒童作為對照組。毛細組年齡2～24個月，平均年齡（14.06±3.02） 個月，男16例，女14例；對照組年齡6～18個月，平均年齡 （13.59±2.46） 個月，男21例，女17例，2組研究對象的一般資料比較差異無統計學意義 （P> 0.05），具有可比性。本研究經我院倫理委員會審批同意。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 毛細組患兒納入標準：（1） 符合RSV感染毛細支氣管炎的診斷標準［8］；（2） 符合中醫兒科病癥診斷中咳嗽喘息的診斷依據［9］，中醫辨證為痰熱蘊肺；（3）所有患兒均接受病毒檢測確定為RSV，檢測鼻咽部分泌物RSV 抗原 （+） 和 （或） 檢測血清 RSV-IgM （+）；（4） 患兒監護人知曉并簽署知情同意書。

1.2.2 對照組兒童納入標準：（1） 身體健康；（2） 無喘息病史；（3） 無先天性疾病；（4） 無精神障礙。

1.2.3 排除標準：（1） 發病時間>72 h；（2） 合并先天性心臟病；（3） 存在支氣管肺部發育不良；（4） 存在支氣管異物；（5） 合并中樞神經系統性疾病；（6） 合并結核感染或細菌性肺炎；（7） 既往存在哮喘史。

1.3 試劑與儀器

液相色譜質譜系統 （美國Waters ACQUITY公司，器械準字：20142401651）、質譜檢測儀 （美國AB Sciex公司，型號：Triple TOFTM 5600）、超純水機 （美國Millipore公司，型號：Milli-Q，器械準字：20122450103）、乙腈 （德國Merck公司）、甲酸（美國Sigma-Aldrich公司）。

1.4 方法

1.4.1 治療方法：毛細組患兒均接受定喘湯治療，定喘湯配方為白果 （去殼，砸碎，炒黃） 9 g、麻黃9 g、蘇子6 g、甘草3 g、款冬花9 g、杏仁6 g、桑皮9 g、黃芩6 g、制半夏9 g。無風寒外束者酌情減少麻黃劑量，痰稠難咳者原方方劑組成劑量倍黃芩。溫水煎服，15～20 mL/次，2次/ d，連續治療10 d。

1.4.2 樣品采集與處理方法：采集2組患兒治療前后的空腹靜脈血5 mL，室溫靜置，-80 ℃冰箱保存。檢測前解凍血清，離心 （8 000 r/min） 10 min，取上清100 μL，加400 μL純水渦旋1 min，再次離心10 min，提取上清液。

1.4.3 代謝組學分析方法：

1.4.3.1 液相條件 通過液相色譜質譜系統，色譜柱（Hypersil GOLDTM，規格為50 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱溫60 ℃。流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈，流速0.4 mL/min，進樣量5 μL。梯度洗脫程序為0～0.5 min，5% B；0.5～2.5 min，5%～60% B；2.5～8 min，60%～100% B；保持2 min；0.1 min內回到初始比例5% B。

1.4.3.2 質譜條件 采用質譜檢測儀，參數設置為質譜掃描范圍80～1 000 m/z，碰撞電壓10 V；信息采集掃描范圍60～1 000 m/z，碰撞電壓40 V；氣簾流速30 psi，霧化流速55 psi，加熱流速55 psi；離子源溫度550℃，正離子噴霧電壓5.5 kV；離子源溫度450 ℃，負離子噴霧電壓5.5 kV。

1.5 統計學分析

采用SIMCAP 11.0軟件進行統計分析，建立主成分分析 （prineiple component analysis，PCA）、正交偏最小二乘法判別分析 （orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA） 2種數學模型，對其相應主成分的變量重要性 （variable importance in the proect，VIP） 進行計算，組間比較采用t檢驗，采用SPSS 25.0軟件進行數據處理，差異性代謝物需同時滿足VIP值>2、P< 0.05。

2 結果

2.1 2組代謝產物差異分析

建立OPLS-DA模型 （圖1），2組分離趨勢明顯，說明2組的代謝產物有明顯差異，響應置換檢驗 （圖2），參數：R2Y= 0.824，Q2=0.614，說明模型有效；根據OPLS-DA模型，提取VIP > 2，同時行t檢驗，且滿足P< 0.05，篩選差異性代謝物，分別為3個溶血磷脂酰膽堿 （lyso-phosphatidylcholine，LPC）：LPC 18∶2 sn-1、LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2，苯丙氨酸 （phenylalanine，Phe）和3個磷脂酰膽堿 （phosphatidylcholine，PC）：PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1，見圖3，表1、2。

圖1 健康兒童與RSV毛細支氣管炎患兒的OPLS-DA得分Fig.1 OPLS-DA scores of healthy children and children with RSV bronchiolitis

圖2 置換檢驗Fig.2 Permutation test

圖3 VIP圖Fig.3 VIP Chart

表1 2組差異代謝產物的相對含量Tab.1 Relative content of different metabolites between the two groups

表2 2組兒童差異代謝產物的VIP值、t值及變化趨勢Tab.2 VIP values，t values，and change in the trends of differential metabolites between the two groups of children

2.2 毛細組治療前后的代謝組學變化

建立OPLS-DA模型圖 （圖4），2組分離趨勢明顯，說明2組的代謝產物有明顯差異；置換檢驗 （圖5） 參數顯示，R2Y= 0.742，Q2=0.580，說明模型有效；提取VIP > 2且P< 0.05的變量，篩選差異性代謝物，分別為3個LPC （LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1），Phe，PC 34∶2，SM34∶1，去甲-戊二酰胺，見圖6，表3、4。

圖4 RSV毛細支氣管炎患兒治療前后OPLS-DA得分圖Fig.4 OPLS-DA score map of children with RSV bronchiolitis before and after treatment

圖5 RSV毛細支氣管炎患兒治療前后的置換檢驗Fig.5 Permutation test of children with RSV bronchiolitis before and after treatment

圖6 基于OPLS-DA分析的VIP圖Fig.6 VIP chart based on OPLS-DA analysis

表3 RSV毛細支氣管炎患兒治療前后差異代謝產物的相對含量Tab.3 Relative content of differential metabolites in children with RSV bronchiolitis before and after treatment

表4 RSV毛細支氣管炎患兒治療前后差異代謝產物的VIP值、t值及變化趨勢Tab.4 VIP values，t-values，and change in the trends of differential metabolites in children with RSV bronchiolitis before and after treatment

2.3 代謝產物的動態變化

結合上述健康兒童、RSV感染毛細支氣管炎經定喘湯治療前后的代謝產物的變化，發現LPC 18∶0 sn-1、LPC 18 ∶0 sn-2、LPC 18 ∶2 sn-1、PC 34 ∶3、PC 34∶2、PC 34∶1、LPC 16∶0 sn-2可反映患兒從健康到發病再到治療后好轉的折線變化趨勢，其中變化最明顯的為LPC 18∶0 sn-1以及LPC 18∶0 sn-2，見表5。

3 討論

本研究對比正常組和毛細組的代謝指標，結果顯示，毛細組患兒表現為LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的升高以及LPC 18∶2 sn-1、Phe、PC 34∶3、PC 34∶2、PC 34∶1的降低，表明RSV感染后主要影響患兒的脂肪代謝。該病在中醫上屬外感熱證范疇，研究［10］顯示，脂肪代謝與熱證相關，因此患兒感染RSV后會出現脂肪代謝紊亂。LPC是氧化損傷低密度脂蛋白的主要成分，主要誘發炎癥反應［11］。PC具有乳化功能，可將膽固醇和脂肪酸化為微粒，使之排出，同時可防御病毒［12］。研究［13-14］發現，磷脂代謝紊亂及氨基酸代謝紊亂均為免疫功能下降，RSV感染后均有體現。

定喘湯主治痰熱內蘊、肺氣上逆，本研究中毛細組均予定喘湯治療，對比其治療前后共篩選出7個差異代謝物，包括LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1、Phe、PC 34∶2、SM34∶1以及去甲-戊二酰胺。Phe可在腸道中分解代謝，因此RSV感染后會使腸道菌群紊亂，影響免疫功能［15］。鞘磷脂主要可引起過敏及炎癥反應，還可抑制病毒的釋放。定喘湯中以桑白皮為君藥，其所含的酸性物質影響血小板中環氧合酶的活性，減少炎癥反應，還能增強免疫系統的調控，因此定喘湯治療后，Phe、SM34∶1水平上升。LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2、LPC 16∶0 sn-1為脂代謝的相關產物，經治療后均明顯下降，中醫中認為甘草可調和脾胃，調節脂代謝紊亂，款冬花、制半夏等藥物具有消炎殺菌的作用，均可達到抗病毒、增強免疫力等功效。

綜上所述，RSV感染后脂代謝紊亂最為明顯，LPC 18∶0 sn-1、LPC 18∶0 sn-2的水平經定喘湯治療后變化最大，考慮與定喘湯通過改善脂代謝水平、增強抵抗力，以此促進疾病的恢復有關。本研究中代謝組學分析模型均穩定且可靠，證實選取的差異性代謝物較好。但本研究選取的樣本量較小，后期需進行多中心的大樣本研究，進一步驗證本研究結論。