鋅指蛋白502在肺腺癌中的表達及作用機制

馬小雯，范明偉，杜江

（中國醫科大學 1.基礎醫學院病理學教研室；2.臨床二系106期，沈陽 110122）

肺癌是全球發病率最高的癌癥，嚴重影響人類健康［1］。肺腺癌是肺癌的主要組織學亞型，發病率逐年增加，其5年生存率僅約為 15%，絕大多數患者在診斷時已為晚期［2］。因此，尋找肺腺癌的預后標志物和治療靶點至關重要。

p53是一種經典的抑癌基因，被稱為“基因組守護者”，其在保持基因組完整性方面具有關鍵作用［3-4］。p53在肺癌患者中被認定為早期診斷標志物［5］。當細胞受到外界環境刺激時，p53可以介導細胞周期阻滯，從而導致細胞衰老或細胞凋亡［6］。GADD45是p53的靶基因，已被證明其可以在G2/M細胞周期檢查點抑制細胞周期進程。GADD45在G2/M檢查點通過抑制細胞周期特異性激酶CyclinB1和CDC2來阻滯細胞周期［7］。鋅指蛋白502 （zinc finger protein 502，ZNF502） 是C2H2型鋅指蛋白家族成員，定位于人類染色體3p21.31。LI等［8］研究顯示ZNF502可能是抑郁癥的易感基因，截至目前，ZNF502在惡性腫瘤組織中的表達模式和生物學功能尚不清楚。

本研究采用生物信息學分析方法和Western blotting實驗探討ZNF502在肺腺癌患者中的表達模式，利用一系列細胞功能實驗探究ZNF502對肺腺癌細胞增殖能力的影響，為進一步研究ZNF502在肺腺癌發生發展中的具體作用機制提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 生物信息學分析

1.1.1 TCGA數據庫：采用仙桃學術在線網站（https：//www.xiantao.love/products） 對TCGA數據庫中肺腺癌數據集進行表達差異和預后相關性分析。

1.1.2 GEPIA數據庫：采用GEPIA數據庫 （http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php） 對ZNF502和TP53mRNA的表達相關性進行預測。設置篩選條件為 （1） Gene：ZNF502，TP53；（2） Datasets selection：BRCA；（3） Correlation Coefficient：Person。

1.1.3 Linkedomics在線網站：應用Linkedomics （http：//www.linkedomics.org/login.php） 對ZNF502進行基因集富集分析 （Gene Set Enrichment Analysis，GSEA） 。

1.2 細胞培養

永生人支氣管上皮細胞系HBE，人類肺腺癌細胞系H1299、LK2，A549購自武漢普諾賽 （中國Procell公司）。所有細胞均使用RPMI-1640 （美國Invitrogen公司） 培養，培養基中添加10% 胎牛血清 （美國Invitrogen公司），1%青霉素和鏈霉素 （美國Sigma-Aldrich公司）。所有細胞均置于溫度37 ℃，5% CO2的細胞培養箱中。所有細胞系均采用短串聯重復序列（short tandem repeat，STR） 進行鑒定，無支原體污染。

1.3 質粒構建

過表達質粒pCMV6-ZNF502-Myc-DDK和對照質粒PCMV6購自美國Origene公司。敲除序列pLV2-U6-ZNF502-sgRNA-cas9-GFP由吉凱基因 （中國吉凱基因公司） 設計。轉染均使用lipo3000（美國Invitrogen公司）。

1.4 Western blotting

采用NP40裂解液 （中國碧云天公司） 從細胞中提取總蛋白。12 000 r/min，4 ℃離心保留上清液，并使用BCA試劑盒定量 （中國碧云天公司）。100 ℃金屬浴加熱樣品5 min，使蛋白質變性。采用10% SDSPAGE分離40 μg蛋白，100 V，60 min將蛋白轉印到PVDF膜 （美國Millipore公司） 上。5%的脫脂奶粉室溫封閉PVDF膜2 h后，在4 ℃與以下抗體孵育過夜：ZNF502、GAPDH、P53、CyclinB1、CDK1、GADD45a和Myc-tag （均以1∶1 000稀釋，美國Abcam公司）。24 h后將PVDF膜與以1∶3 000稀釋的辣根過氧化物酶偶聯抗小鼠IgG和抗兔IgG （中國碧云天公司） 室溫孵育2 h。增強化學發光法 （electrochemiluminescence，ECL） 檢測蛋白表達，采用ChemiDoc Imaging System進行采集圖像。采用GAPDH作為對照來計算相對蛋白表達量。

1.5 免疫熒光實驗

在細胞傳代培養時，將細胞接種到預先放置蓋玻片的24孔板中，待細胞融合率接近80%時，磷酸鹽緩沖液清洗2次。室溫下用4% 多聚甲醛敷育細胞10 min，0.5% Triton X-100通透液室溫下敷育細胞10 min，使用含有3% 牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液封閉細胞2 h。將細胞與溶有ZNF502抗體 （1∶100） 的磷酸鹽緩沖液在4°C下孵育過夜。24 h后將細胞使用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，與熒光二抗Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 594 （1∶50，中國碧云天公司） 在室溫下孵育1 h，避光。最后，用含4，6-二氨基-2-苯基吲哚 （4，6-diamino-2-phenyl indole，DAPI） 的封片劑染色細胞核10 min。將細胞爬片使用共聚焦顯微鏡獲取圖像。實驗重復3次以上。

1.6 MTS細胞增殖實驗

培養過表達ZNF502的A549細胞和敲除ZNF502的LK2細胞到對數生長期。取96孔細胞培養板，每孔加入0.1 mL 2 000個上述細胞的RPMI1640培養液，設置5個復孔。在37 ℃ 5%CO2的培養箱中分別培養24、48、72和96 h后，每孔加入20 μL MTS，繼續培養1.5 h后進行顯色。在酶聯檢測儀波長490 nm處檢測各孔吸光度 （optical density，OD）。實驗重復3次以上。

1.7 集落形成實驗

培養過表達ZNF502的A549細胞和敲除ZNF502的LK2細胞到對數生長期。在6孔板每個孔中加入1 000個細胞，放入CO2培養箱培養。1周后，當肉眼可見集落形成時，取出6孔板。每孔加入1 mL冰甲醇固定15 min后，加入結晶紫染色10 min，自來水反藍。計數集落，實驗重復3次以上。

1.8 EdU增殖實驗

培養過表達ZNF502的A549細胞和敲除ZNF502的LK2細胞至融合率為70%～80%時，用20 μmol/L的EdU溶液 （中國雅酶生物公司） 在37 ℃ 5% CO2培養箱中孵育細胞1 h后，棄培養基。用磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次之后，所有步驟按照免疫熒光實驗進行。

1.9 統計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行統計分析，組間差異采用t檢驗。采用Kaplan-Meier法和多因素Cox回歸法分析ZNF502與生存預后的關系。P< 0.05為差異有統計學意義。所有實驗至少重復3次。

2 結果

2.1 ZNF502在肺腺癌組織和細胞中的表達（圖1）

對TCGA公共數據庫中的多種癌和癌旁樣本進行差異分析。結果顯示，ZNF502在多種腫瘤組織中的mRNA表達水平顯著低于癌旁組織 （圖1A）。且在配對的肺腺癌組織中表達顯著低于癌旁組織 （P<0.01，圖1B）。肺腺癌細胞系A549，H1299和LK2中ZNF502的蛋白水平明顯低于正常支氣管上皮細胞HBE （圖1C）。本研究選取表達量最低的A549細胞系進行后續的過表達實驗，選取表達量相對較高的LK2細胞進行后續的敲除實驗。免疫熒光實驗結果顯示，內源和外源的ZNF502均主要表達于肺腺癌細胞的細胞核中 （圖1D）。

圖1 ZNF502在肺腺癌組織和細胞中低表達Fig.1 ZNF502 was low expressed in lung adenocarcinoma tissues and cells

2.2 ZNF502過表達與患者預后的相關性

對TCGA數據庫中的肺腺癌患者臨床數據進行Kaplan-Meier生存分析。結果顯示，ZNF502高表達的肺腺癌患者總體生存期 （overall survival，OS） 和疾病特異性生存期 （disease specific survival，DSS） 顯著高于ZNF502低表達的患者，且風險比率 （hazard ratio，HR） 均<1 （P= 0.014和P= 0.018，圖2A、2B）。將患者按ZNF502的mRNA表達量分群并繪制風險因子圖，發現ZNF502高表達的患者存活更多且有更低的風險評分 （圖2C）。接下來對肺腺癌相關的臨床病理因素和ZNF502的表達進行多因素Cox分析，結果顯示，ZNF502可以作為評價肺腺癌預后的獨立保護因素。ZNF502可以聯合T分期和N分期作為肺腺癌的預后評價因子 （HR=0.738，P< 0.001，圖2D）。

圖2 ZNF502高表達患者預后良好Fig.2 A high level of ZNF502 expression was associated with a good prognosis

2.3 ZNF502過表達抑制肺腺癌細胞增殖能力（圖3）

利用linkedomics網站進行在線GSEA富集分析，結果顯示，ZNF502主要與細胞周期、帕金森病和泛素化等通路呈負相關 （圖3A、3B）。對TCGA數據庫的肺腺癌數據集進行通路相關性分析，ZNF502與G2/M檢查點通路顯著負相關 （P= 0.013，圖3C）。結果顯示，ZNF502可能通過調控細胞周期來影響患者的預后。細胞周期主要控制細胞的增殖能力。Western blotting實驗結果顯示，ZNF502在A549細胞中被成功過表達，在LK2細胞中被成功敲除 （圖3D）。MTS、集落形成實驗和EdU增殖實驗結果顯示，過表達ZNF502顯著抑制肺腺癌細胞的增殖能力。而敲除ZNF502則顯著增強肺腺癌細胞的增殖能力 （圖3E～3G）。

圖3 ZNF502過表達抑制肺腺癌細胞增殖Fig.3 Overexpression of ZNF502 inhibited the proliferation of lung adenocarcinoma cells

2.4 ZNF502通過激活P53通路抑制細胞周期

利用GEPIA網站對ZNF502和下游基因進行相關性分析，結果顯示，ZNF502和TP53的表達呈正相關（r= 0.14，P= 0.001 4，圖4A）。接下來在過表達ZNF502的A549細胞中檢測p53下游蛋白表達水平。Western blotting實驗結果顯示，p53，GADD45a表達明顯上升，而G2/M檢查點關鍵蛋白CyclinB1和CDK1表達明顯下降 （圖4B）。在ZNF502敲除的LK2細胞中，上述蛋白表達量的變化恰恰相反 （圖4C）。過表達ZNF502可能通過激活p53-GADD45a通路抑制細胞G2/M轉化，從而抑制肺腺癌細胞的增殖能力。

圖4 ZNF502通過激活p53通路抑制細胞周期Fig.4 ZNF502 inhibited the cell cycle by activating the p53 pathway

3 討論

ZNF502是鋅指蛋白轉錄因子家族的成員，其在肺癌中的表達模式和生物學功能仍未有文獻報道。此外，ZNF502表達與患者預后之間的相關性也未見文獻報道。本研究結果顯示，與癌旁組織相比，ZNF502在肺腺癌組織中的表達相對較低。ZNF502主要定位在細胞核中發揮生物學功能。此外，ZNF502的高表達與患者的良好預后呈正相關，ZNF502或許可以作為一個新的評價肺腺癌良好預后的標志物。而且，ZNF502mRNA的表達可以作為評估為肺腺癌進展的獨立保護因素。

GSEA富集分析以及一系列檢測細胞增殖能力的功能學實驗表明，ZNF502可能通過調節p53信號通路來抑制細胞增殖能力。ZNF502和TP53的表達呈正相關。p53已被證實是調控細胞周期的上游關鍵因子，發揮抑制腫瘤細胞增殖的作用［9-10］。野生型p53的高表達與腫瘤放化療敏感性和良好預后密切相關。在基因組受到外界損傷時，p53響應外界刺激，介導細胞周期阻滯，開啟DNA損傷修復通路。當基因組損傷不可修復時，p53主要開啟細胞凋亡通路，引導細胞程序性死亡［11-12］。

本研究進一步采用Western blotting檢測p53通路關鍵下游蛋白。結果顯示，ZNF502通過上調p53的表達水平，激活下游關鍵因子GADD45a，從而使細胞周期阻滯在G2/M檢查點。突變型p53在腫瘤中將發揮與野生型p53截然不同的功能［13］。臨床約有50%的肺癌患者存在p53突變。p53蛋白可以發揮轉錄因子的功能，其突變位點主要位于中央的DNA結合結構域。R175、G245、R248、R249、R273和R282是最常見的6個錯義突變位點。突變的p53半衰期明顯延長，不再具有野生型p53抑制細胞增殖的能力。突變型p53誘導上皮-間充質轉化，放化療抵抗在腫瘤細胞的侵襲和轉移中起關鍵作用［14］。本研究中使用的A549和LK2細胞都不存在p53突變，僅檢測了ZNF502對野生型p53的調控作用，ZNF502對突變型p53的影響將在未來的實驗中進一步探究。

綜上所述，ZNF502在肺腺癌組織中顯著低表達，主要定位于細胞核中且與肺腺癌患者的良好預后呈正相關。ZNF502通過激活p53-GADD45a通路抑制細胞G2/M轉化，從而抑制肺腺癌細胞的增殖能力。