CDK5對胃癌PD-L1表達及生物學特性的影響

黃誼強，王子明，羅楊，羅水妹，謝賢和，2，3，張帆，2，3

（1.福建醫科大學附屬第一醫院腫瘤內科，福建醫科大學分子腫瘤研究所，福州 350005；2.福建醫科大學附屬第一醫院濱海院區國家區域醫療中心腫瘤內科，福州 350212；3.福建省腫瘤精準診療重點實驗室，福州 350005）

胃癌惡性度高，全球發病率和死亡率分別高居癌癥的第5位和第4位［1］。近年來，PD-1/PD-L1抑制劑對惡性腫瘤 （如惡性黑色素瘤、肺癌等） 的治療效果取得了里程碑式的進展［2］，但在胃癌方面卻仍未獲得預期療效［3］。因此，探討調控胃癌PD-L1表達進而抑制其介導的免疫逃逸的新策略至關重要。CDK5既往被認為主要在神經系統中發揮作用，近年來發現CDK5參與腫瘤的免疫、凋亡、增殖、轉移等［4-7］，是腫瘤靶向治療及免疫治療的潛在靶點。研究［4，8］表明，CDK5可調控PD-L1，在不同類型的腫瘤中機制也不盡相同，而其在胃癌中的調控作用尚未明確。本研究擬探討CDK5對胃癌PD-L1表達及腫瘤增殖、遷移等特性的影響，以及抑制CDK5在胃癌免疫治療及靶向治療中的可行性。

1 材料與方法

1.1 數據來源

通過癌癥基因組圖譜 （The Cancer Genome Atlas，TCGA） 數據庫 （https：//portal.gdc.cancer.gov/） 下載375例胃癌樣本和32例正常組織樣本的轉錄組每千個堿基的轉錄每百萬映射讀取的片段數 （fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments，FPKM） 數據及相應的臨床病理和生存資料。

1.2 實驗材料及方法

1.2.1 主要試劑和儀器：人胃癌細胞株BGC-823購自上海翼和應用生物技術有限公司；CDK5抑制劑20-223購自美國MedChemExpress公司；CDK5過表達質粒委托北京擎科生物公司合成；PD-L1抗體購自美國Proteintech公司；β-actin抗體購自英國Abcam公司。凝膠成像儀 （Biosciences AccuriC6型） 購自美國Bio-Rad公司。

1.2.2 細胞培養：用含15%胎牛血清、1%雙抗 （青霉素1 000 U/mL、鏈霉素0.1 mg/mL） 的DMEM培養基，于37 ℃、5%CO2恒溫培養人胃癌BGC-823細胞。

1.2.3 CCK-8法：測定CDK5 抑制劑 20-223 分別作用24、48、72、96 h對細胞活力的影響及其IC50。

1.2.4 Western blotting：20 μmol/L CDK5抑制劑處理胃癌BGC-823細胞24 h，按常規方法提取細胞總蛋白。上樣 （每泳道20 μg） 后，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉至 0.45 μm PVDF膜，室溫封閉1 h。4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗脫，ECL化學發光顯影。β-actin作為內參照。導出照片后用Adobe Photoshop軟件讀取各條帶灰度值。

1.2.5PD-L1表達檢測：1/1 000DMSO及0、0.16、0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00 μmol/L CDK5抑制劑作用胃癌BGC-823細胞24 h，實時定量聚合酶鏈式反應 （real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR） 檢測PD-L1表達；10 ng/mL干擾素-γ （inteferon-γ，IFN-γ） 5 μmol/L CDK5抑制劑、10 ng/mL IFN-γ+5 μmol/L CDK5抑制劑分別作用于胃癌BGC-823細胞24 h，qPCR檢測PD-L1表達；用CDK5過表達質粒、psPAX2質粒及VSVG質粒構建CDK5過表達穩轉株，qPCR檢測PD-L1表達。

1.2.6 細胞周期檢測：20 μmol/L CDK5抑制劑分別抑制胃癌BGC-823細胞24、48、72、96 h，碘化丙啶染色，流式細胞術檢測細胞周期。

1.2.7 細胞凋亡檢測：80、40 μmol/L CDK5抑制劑抑制胃癌BGC-823細胞CDK5，Annexin V-FITC/碘化丙啶染色，流式細胞術檢測細胞凋亡。

1.2.8 細胞遷移趨化能力檢測：2 μmol/L CDK5抑制劑作用胃癌BGC-823細胞24 h，Transwell 測定細胞遷移趨化能力；1 μmol/L CDK5抑制劑作用胃癌BGC-823細胞48 h，劃痕實驗測定細胞遷移能力。

1.2.9 細胞增殖檢測：0.02、0.04 μmol/L CDK5抑制劑作用胃癌BGC-823細胞2周，克隆形成實驗檢測細胞增殖能力。

1.3 統計學分析

采用GraphPad Prism 8進行統計分析，計量資料2組間比較采用t檢驗，2組以上樣本數據采用單因素方差分析及兩兩比較。P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CDK5及PD-L1的表達

對TCGA數據庫的中CDK5表達量進行泛癌分析，結果顯示，CDK5在多種癌癥中均呈高表達，見圖1A。對胃癌CDK5及PD-L1表達量進行分析，發現配對樣本及非配對樣本CDK5及PD-L1表達量均顯著高于正常樣本，見圖1B～1E。

圖1 CDK5與PD-L1差異表達分析Fig.1 Differential expression analysis of CDK5 and PD-L1

2.2 CDK5與胃癌分期、免疫檢查點、免疫細胞相關

構建CDK5高、低表達組差異基因熱圖及臨床特征熱圖，對CDK5與免疫檢查點 （包括PD-L1）、免疫細胞浸潤進行相關性分析，結果顯示，CDK5與胃癌免疫檢查點、免疫細胞浸潤和N分期相關。

2.3 CDK5高、低表達組的基因本體 （Gene Ontology，GO） 功能分析和京都基因和基因組數據庫 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG） 通路富集分析

GO分析表明，CDK5顯著富集的生物過程包括肌肉收縮、肌肉細胞分化等。顯著富集的細胞成分包括神經元胞體、突觸前結節肌節、肌肉纖維等。顯著富集的分子功能包括離子通道活性、被動膜轉運體活性肌肉結構成分等。

KEGG通路富集分析發現，差異基因富集通路有鈣離子信號轉導通路、cAMP信號轉導通路、cGMP-PKG信號轉導通路、胃酸分泌通路等。

2.4 CDK5抑制劑對胃癌BGC-823細胞活力的影響

檢測不同濃度CDK5抑制劑20-223對BGC-823細胞活力的影響，結果顯示，24、48、72、96 h的IC50分別為131.70、40.72、1.33、0.90 μmol/L，見圖2。

圖2 CDK5抑制劑20-223對胃癌BGC-823細胞的劑量-反應曲線Fig.2 Dose-response curve of CDK5 inhibitor 20-223 on gastric cancer BGC-823 cells

2.5 抑制及過表達CDK5對PD-L1表達的影響

應用CDK5抑制劑對胃癌BGC-823細胞干預24 h，Western blotting及qPCR檢測顯示，PD-L1蛋白及mRNA表達顯著下調 （P= 0.013 4，P= 0.000 4）。應用不同濃度CDK5 抑制劑 20-223對胃癌BGC-823細胞干預24 h，發現2.5 μmol/L抑制劑可最大程度抑制PD-L1轉錄。見圖3A～3C。

圖3 CDK5調控PD-L1表達及其機制.3 CDK5 regulates PD-L1 expression and its mechanism

2.6 CDK5抑制劑挽救IFN-γ促進的PD-L1轉錄

IFN-γ可顯著促進PD-L1轉錄，1.25 ng/mL IFN-γ可最大程度促進PD-L1轉錄，而CDK5抑制劑可極大程度挽救IFN-γ促進的PD-L1轉錄，提示CDK5通過IFN-γ激活的通路下調PD-L1表達。見圖3D。

2.7 過表達CDK5促進PD-L1轉錄

CDK5過表達效率達10.80倍；PD-L1相對表達值升高1.85倍。見圖3F。

2.8 CDK5抑制劑對胃癌BGC-823細胞周期的阻滯作用

應用20 μmol/L CDK5抑制劑干預胃癌BGC-823細胞，流式細胞術周期檢測結果顯示，與對照組相比，CDK5抑制劑組細胞周期被抑制在G2/M期，干預12 h、24 h、48 h時，G2/M期細胞比例呈遞增趨勢，見圖4。

圖4 抑制CDK5致胃癌BGC-823細胞周期抑制于G2/M期Fig.4 Inhibition of CDK5 in gastric cancer BGC-823 cell cycle arrest in G2/M phase

2.9 抑制CDK5促進胃癌BGC-823細胞凋亡

應用80、40 μmo/L CDK5抑制劑干預胃癌BGC-823細胞48 h，流式細胞術周期檢測結果顯示，與對照組相比，40 μmol/L組早期凋亡及晚期凋亡均無明顯差異，但總凋亡細胞比例增加 （P= 0.037 7），80 μmol/L組較40 μmol/L組進一步增加 （P= 0.000 5）；80 μmol/L組早期及晚期凋亡細胞比例均增加 （P=0.000 2，P= 0.003 9）。以上均提示抑制CDK5可促進細胞凋亡。見圖5。

圖5 抑制CDK5對胃癌BGC-823細胞凋亡的影響Fig.5 Effects of inhibiting CDK5 on the apoptosis of gastric cancer BGC-823 cells

2.10 抑制CDK5減弱胃癌BGC-823細胞遷移能力

劃痕實驗結果顯示，CDK5抑制劑組遷移率明顯低于對照組 （4.39% vs 24.37%，P= 0.002 6），表明抑制CDK5使胃癌BGC-823細胞遷移趨化能力明顯減弱。見圖6A、6B。

圖6 抑制CDK5對胃癌BGC-823細胞遷移能力的影響Fig.6 Effects of inhibiting CDK5 on the migration ability of gastric cancer BGC-823 cells

2.11 抑制CDK5降低胃癌BGC-823細胞遷移趨化能力

Transwell實驗結果顯示，CDK5抑制劑組細胞穿過數量明顯低于對照組 （20倍物鏡下15.20個/視野 vs 65.87個/視野，P= 0.002 5），表明抑制CDK5可使胃癌BGC-823細胞遷移趨化能力明顯減弱。見圖6C、6D。

2.12 抑制CDK5降低胃癌BGC-823細胞增殖能力

與對照組 （克隆形成率80.87%） 相比，CDK5抑制劑0.02 μmol/L組克隆形成能力 （80.13%） 無明顯改變 （P= 0.996 1），0.04 μmol/L組克隆形成能力（32.60%） 則明顯降低 （P= 0.000 4）。見圖7。

圖7 抑制CDK5對胃癌BGC-823細胞克隆形成能力的影響Fig.7 Effects of inhibiting CDK5 on the colony formation ability of gastric cancer BGC-823 cells

3 討論

腫瘤主要表現為腫瘤細胞增殖增加，侵襲增強，凋亡減少，代謝特征和免疫微環境改變，血管結構異常，以及免疫逃逸等［9］。對應這些腫瘤特性，本研究探索了CDK5對胃癌BGC-823細胞免疫檢查點PD-L1及細胞周期、凋亡、遷移的影響。

本研究結果顯示，抑制胃癌BGC-823細胞CDK5表達可致PD-L1mRNA和蛋白表達均下調，過表達CDK5則可促進PD-L1mRNA表達，與本研究中生物信息學預測提示的“CDK5及PD-L1在胃癌中均高表達，且二者呈正相關”一致，符合轉錄調控或轉錄后調控的特點。

胃癌中，PD-L1 表達主要受IFN-γ/JAK/STAT1/IRF1通路轉錄調控［10］。IRF1主要由磷酸化STAT1轉錄促進調控，而JAK、STAT的活性都通過磷酸化調節，是CDK5作用的潛在位點。本研究發現，抑制胃癌BGC-823細胞CDK5可挽救IFN-γ刺激的PD-L1mRNA表達，提示CDK5在胃癌BGC-823細胞中通過IFN-γ通路轉錄促進PD-L1表達。在髓母細胞瘤中，CDK5也通過IFN-γ通路調控PD-L1，CDK5并非直接作用于此通路引起JAK、STAT1磷酸化水平及IRF1表達水平改變，而是通過IRF2BP2/IRF2/IRF1途徑轉錄促進PD-L1表達，但CDK5直接作用的位點尚未明確［4］。PTPN2、SOCs、PTP1B、PIAS等多種分子均可作用于JAK/STAT 通路，調控IFN-γ誘導的基因 （如PD-L1） 表達，可能是胃癌CDK5間接作用于IFN-γ/JAK/STAT通路促進PD-L1表達的潛在旁路［11-14］。

在肺腺癌中，敲低CDK5可下調PD-L1表達，但PD-L1mRNA水平卻沒有改變，表明CDK5不是在轉錄水平調控PD-L1，而是通過抑制TRIM21泛素化活性，抑制PD-L1泛素化降解，最終導致PD-L1上調［8］。故胃癌BGC-823細胞中CDK5調控PD-L1機制與肺腺癌中不同。表明不同癌癥中CDK5調控PD-L1的方式不盡相同。

轉錄因子是轉錄調控的關鍵，PD-L1啟動子報告基因可檢測轉錄水平的改變，CDK5的直接作用分子及其磷酸化位點則需要蛋白質譜磷酸化作用分析、蛋白質譜相互作用分析并結合測序通路分析進一步探索，并最終進行體外驗證。

綜上所述，本研究結果顯示，CDK5與PD-L1在胃癌中均高表達且呈正相關，在胃癌BGC-823細胞中，CDK5通過IFN-γ通路促進PD-L1表達，CDK5抑制劑在下調PD-L1的同時，促進細胞凋亡、阻滯細胞周期、降低細胞遷移能力及克隆形成能力。