我國特有植物菱葉鳳仙花的繁育系統及其與同屬植物的比較

林 祎,郭銀巧,王 瓊

(1.西華師范大學 a.生命科學學院,b.西南野生動植物資源保護教育部重點實驗室,四川 南充 637009;2.中國農業出版社,北京 100125)

全世界鳳仙花屬(Impatiens)物種超過1 000種,中國目前記載有352種,其中特有種273種,約占全世界的1/4,大部分在西南地區,其中四川分布119種[1]。該屬植物色澤艷麗,花型獨特,著生方式和部位多樣,普遍具有較高的觀賞價值,也吸引了各類型的傳粉者,被譽為“雙子葉的蘭花”[2]。植物繁育系統是指影響后代遺傳組成的所有有性特征,包括花形態特征、開放式樣、花部壽命、傳粉者種類、訪問頻率和交配系統,其中交配系統是核心,指居群個體間的交配式樣,即自交和異交狀態的總和[3]。遠緣異交的成本較高,自交會導致育性衰退,因此很多植物傾向于選擇異交與自交動態共存的混合式交配機制,這利于植物種群在各種環境中生存擴展,是植物對時空、傳粉媒介、環境及自身的一種折中的適應機制[3]。

鳳仙花屬植物的觀賞性、入侵性等特性與其繁育系統密切相關。一般異交系花朵的觀賞性大于自交系花朵,比如小花鳳仙花(I.parviflora)傳粉者少,具有高度自交的特性,其花朵色淡且小,而卡佩鳳仙花(I.capensis)異交系花朵對花部特征的能量投入比同種自交系花朵高出100倍,其色澤艷麗,花型更大[4]。在物種入侵方面,一些自交性較強的鳳仙花入侵力更強,在入侵早期可以快速產生大量自交后代順利度過“瓶頸期”,因此對入侵種的繁殖性狀和繁育系統進行分析,可以探明其種群擴散和分布趨勢,并以此制定相關治理措施[5]。鳳仙花繁育系統對物種保護亦有重要意義,比如I.grandis因生殖力低下和環境變化,在自然界面臨生存威脅,研究這類瀕危物種的繁育系統,可以探究其致瀕機制,從而制定相應的保護計劃[6]。在病蟲害防治方面,有研究發現異交機制可能會溶解鳳仙花的抗性基因,導致病毒感染性增強[7]。總之,研究鳳仙花繁育系統可以為該屬植物的適應性、物種形成機制、多樣性的保護維持、外來入侵防控和瀕危植物保護等研究提供重要的基礎資料。

目前國內外對鳳仙花繁育系統的研究眾多,但迄今尚未發現對菱葉鳳仙花(I.rhombifolia)繁育系統以及鳳仙花屬整體的繁育系統的研究報道。菱葉鳳仙花模式產地為峨眉山,為四川特有種,本文通過測定其田間種群中的花部特征、花期壽命、傳粉者種類及行為、花粉胚珠比(P/O值)、雜交指數(OCI),并結合人工授粉實驗研究該植物的繁育系統,以此對該種進行更好的選種培育。另外,人們普遍將鳳仙花以異交為主的觀點作為共識[8],但Vervoort等[5]在2011年發現了高度自交的特殊種,因此本文期望通過收集并整理國內外已有的鳳仙花繁育系統信息,驗證大部分鳳仙花兼性異交的結論,并從生境、傳粉者等方面解釋其產生的原因,以期更好了解鳳仙花的生活史和進化史,探明鳳仙花屬植物對環境的適應性,對其引種馴化、野生資源開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究地點

峨眉山位于四川盆地西南邊緣,是四川鳳仙花屬植物的分布中心之一。該地最高海拔3 099 m,復雜多樣的地形氣候孕育了豐富的動植物資源。海拔500～2 500 m有14種鳳仙花分布,其中12種為我國特有種[9]。該地氣候類型為亞熱帶濕潤季風氣候,植被類型為常綠闊葉林,土壤類型為黃壤。山區云霧較多,日照較少,雨量較為充沛;平均氣溫為17.2 ℃,最熱月(7月)的平均溫度為26.3 ℃,最冷月(1月)的平均氣溫為7 ℃;年均降水量是1 555.3 mm,全年降水量的70%～80%集中在5—9月。

1.2 研究對象

菱葉鳳仙花分布海拔為380～1 850 m,在峨眉山、都江堰等地均有分布,多生于河岸石縫、林下、水溝邊、山坡路旁等[10],屬一年生草本植物,葉片菱形或近菱形,兩面無毛,花黃色,花期在8—11月。該植物養護成本低,觀賞價值高,在野外成叢分布,綠期長,覆蓋度高,長勢均勻,花朵明黃色,可用來點綴草坪,亦可豐富林下景觀,在城市綠化中具有巨大的潛力。此外,因菱葉鳳仙花具匍匐型生長的特點,還可將其開發為懸垂盆栽類,作為室內觀賞植物[11]。因而,該植物是一種極具開發潛力的野生花卉。

1.3 研究方法

1.3.1 實驗地設置

為更好地選育野生種質資源,于2021年3月將生長在峨眉山中下部(29°36′16″N,103°21′62″E,海拔932 m)的野生菱葉鳳仙花幼苗60株(高約10 cm且長勢相同)帶土移栽至山腰(29°34′39″N,103°16′59″E,海拔1 241 m)。原生地點位于林緣和河邊,移栽地點為農用地,周圍有農田和人工種植的竹林、板栗樹。移栽地中,沿水平方向設置4個小區,每個小區放置15盆(花盆底面直徑25 cm,高30 cm),每盆中移栽1株,盆間隔10 cm。因鳳仙花喜陰濕的習性,故在實驗地上方覆蓋了透光度26.83%±0.66%的遮陽網。

1.3.2 花部綜合特征及開花物候

8月24日—9月28日,隨機挑選25朵花蕾,吊牌標記,觀察開花進程,記錄花蕾期、雄花期、雌花期,同時觀測群體花期壽命。另外選取108朵花蕾進行套袋,開放后對其傳粉通道的長、寬、高,蜜距長度,花蜜體積等進行測定。

1.3.3 訪花昆蟲及其行為

9月12—19日,每天8∶00—16∶00約8個小時,觀察40朵花上的傳粉者種類、數量和訪問頻率,訪問頻率為1 h內昆蟲對目標花朵的訪問次數。9月22日開始選擇20朵花蕾進行標記,每天早上7∶00進行套袋,下午17∶00去袋,統計其坐果和結籽情況,以此推測其夜間傳粉者的存在與否。9月28日開始拍攝昆蟲訪花視頻,描述其訪花行為,并用剪映專業版軟件逐幀分析視頻,記錄單花訪問停留時間。

1.3.4 花粉胚珠比的測定

9月1—5日,隨機采集35朵花蕾,測P/O值:(1)用解剖針將花藥和子房分離,將花藥放入研缽內磨成勻漿,全部轉移到離心管中,定容到4 mL。(2)將花粉溶液搖勻后,用微量加樣器(Eppendorf Research Plus,0.1～2.5 μL,艾本德(上海)國際貿易有限公司)取1 μL溶液,用顯微鏡觀察并統計花粉數,每朵花重復5次,取平均值并計算4 mL溶液中的花粉總數。(3)用解剖針解剖子房,統計單花胚珠數。(4)計算單花P/O值。據Cruden[12]的標準判斷繁育系統:P/O值在2.7～5.4時,閉花受精;18.1～39.0時,專性自交;31.9～396.0時,兼性自交;244.7～2 588.0時,兼性異交;2 108.0～195 525.0時,專性異交。

1.3.5 雜交指數

2021年9月中旬,用數顯游標卡尺(CD-15AX,精確度:0.01 mm,Mitutoyo Corporation)測108朵花傳粉通道的長和寬,并觀察雄蕊和柱頭間的距離[13]。按照Dafni[14]的標準進行雜交系數判斷:(1)花朵直徑<1 mm記為0;1～2 mm記為1;2～6 mm記為2;>6 mm記為3。(2)雌、雄蕊在同一位置記為0;否則記為1。(3)雄蕊與雌蕊二者同時成熟或雌蕊先熟,記為0;雄蕊先熟,記為1。以上三者之和為OCI值。評判標準為:OCI=0時,繁育系統為閉花授精;OCI=1時,為專性自交;OCI=2時,為兼性自交;OCI=3時,為自交親和,有時需要傳粉者;OCI=4時,為異交為主且需要傳粉者。

1.3.6 人工套袋授粉實驗

套袋實驗于2021年9月開始,先后選擇約200朵花作5組處理(5個處理盡量在同一株):處理1,去雄套袋,即不授粉;處理2,不去雄套袋;處理3,人工自交,即去雄套袋,待花進入雌性期,授充足的自株花粉后套袋;處理4,人工異交,即去雄套袋,待花進入雌性期,授充足的異株花粉后套袋;處理5,自然授粉。待果實明顯膨大和伸長時,統計各處理的坐果率、結籽率,并計算自交不親和指數(ISI)和自動融合指數(SFI),其中人工自交與人工異交的坐果率比值為ISI值,ISI>1代表自交親和,在0.2≤ISI≤1代表部分自交不親和,ISI<0.2代表大部分自交不親和,ISI=0代表完全自交不親和。SFI指不去雄套袋與人工異交處理的坐果率比值,SFI>0.2代表允許自動自交和融合生殖[15]。

1.3.7 鳳仙花屬植物繁育系統資料收集以及數據分析

以Impatiens、breeding system等為關鍵詞在百度學術、Happy Botanist、eFlora of India和中國植物志等數據庫里搜集鳳仙花屬繁育系統信息。人工授粉實驗數據經Excel預處理,用SPSS 26進行分析,用One Sample Kolmogorov-Smironv檢驗正態性,坐果率不滿足正態分布,所以采用非參數獨立樣本檢驗比較不同處理組間的指標差異顯著性;結籽率滿足正態分布和方差齊性,采用單因素方差分析。所有數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 花部綜合特征及開花物候

菱葉鳳仙花具營養繁殖的能力,成簇叢生。1株有3～5朵單花,1個花梗上有2朵單花,常存在開放時差,花梗旁有1枚葉片伴生。單花兩側對稱,花內包含繁殖器官,是典型的雄蕊先熟。花蕾黃綠色,蜜距逐漸由彎曲變直(圖1a)。剛開花時,花藥完整,不久后花藥開裂呈散粉狀態,為雄性期(圖1b)。散粉后雄蕊脫落,進入雌性期(圖1c)。花內含1枚雌蕊,雌蕊接收到花粉后很快受精坐果,果實膨大后開裂彈出種子(圖1d)。該植物花色明黃,無明顯氣味,蜜距細直,內含花蜜。傳粉通道長為8.41±1.68 mm (n=108),寬5.69±0.06 mm

(n=108),高6.84±1.04 mm(n=108),蜜距長度為18.14±1.46 mm(n=108),花蜜體積為2.19±1.42 μL(n=105)。該植物花期在8—11月,單花壽命為5.12±0.16 d(n=25),其中雄性期壽命為2.04±0.16 d(n=25),雌性期壽命為2.00±0.17 d(n=25)。

2.2 訪花昆蟲及其行為

菱葉鳳仙花的主要訪花者為三條熊蜂(Bombustrifasciatus)、中華蜜蜂(Apiscerana),其次為短頭熊蜂(B.breviceps)、小豆長喙天蛾(Macroglossumstellatarum),以及少數蝴蝶等(圖2)。三條熊蜂和中華蜜蜂為數量較多且明顯的花粉攜帶者,前者體型較大,頭部為花粉沉積位,具有明顯的傳粉行為,后者體型較小,大多為盜粉者,少數為次級盜蜜者。短頭熊蜂為盜蜜者,直接破壞蜜距獲取花蜜。小豆長喙天蛾為國內罕見的害蟲,具有“采花不攜粉,采蜜不釀蜜”之稱,其出現可能與外來花卉引種有關,外形與蜂鳥相似,訪花時身體呈飛行姿態懸停在花外,僅將長口器伸入花中取蜜,訪花時間極短,據計測其訪問過的雌蕊上的花粉落置數,發現其傳粉效果不明顯。三條熊蜂訪花停留時間平均為1.57±0.17 s(n=68),中華蜜蜂的訪花停留時間為2.73±0.29 s(n=81)。整個實驗地中蜂類傳粉者(三條熊蜂和中華蜜蜂合計)對標記花朵的訪問頻率為0.10±0.01次·h-1(n=119)。夜間開放傳粉的花,其坐果率和結籽率分別為30%和38%,說明存在夜間訪花者,其種類和傳粉行為需進一步調查。

2.3 花粉胚珠比

菱葉鳳仙花單花花粉數量約為140 434.29±5 892.15粒(n=35),單花胚珠數量約為12.60±0.33個(n=35),因此該植物P/O值約為11 442.67±558.28(n=35),據Cruden[12]的標準判斷該植物繁育系統屬于專性異交。

2.4 雜交指數

菱葉鳳仙花的傳粉通道寬平均為5.69 mm,加上旗瓣、翼瓣,花朵直徑明顯大于6 mm,計為3;幼雌蕊被花絲緊緊包被,只有雄蕊脫落后才露出來,是典型的雄蕊先熟,計為1;雌雄蕊無明顯空間隔離,計為0。因此菱葉鳳仙花的OCI為4,按Dafni[14]的標準判斷該植物繁育系統主要為異交,需要傳粉者。

2.5 人工授粉實驗結果

如表1所示:不去雄套袋和去雄套袋后的坐果率分別為5%和0,表明菱葉鳳仙花具有低比率的自動自交能力,不存在無融合生殖現象。相比套袋處理,人工自交、人工異交和自然授粉顯著提高了坐果率(P<0.001),說明缺乏傳粉者等媒介時該種無法正常結實。人工異交和人工自交處理后坐果率無顯著差異,表明該植物自交親和性較高。相較于自然授粉,人工授粉并未顯著提高菱葉鳳仙花的坐果率,可能與實驗地傳粉者較豐富有關。ISI值為0.86,SFI值為0.05,顯示菱葉鳳仙花部分自交親和,幾乎無自動自交和無融合生殖的現象。除了去雄套袋組,所有組的結籽率差異均不顯著(F=0.289,P=0.833)。

表1 菱葉鳳仙花人工授粉實驗結果

2.6 鳳仙花屬植物的繁育系統

搜集的36種鳳仙花在5大鳳仙花熱點地區均有分布,其中印度11種,非洲2種,東南亞4種,喜馬拉雅以東12種以及歐美洲7種。有27種鳳仙花明確記載了生長在林緣、溪流邊等潮濕蔭蔽的微生境,因此即使36個種的宏觀生境不同,但相似的微生境使得它們仍具有一定的可比性。 所有36種鳳仙花都是需要傳粉者的異交植物,其中30%屬于高度異交或專性異交,自交親和的占70%,自交親和中能夠自動自交的占24%,只有小花鳳仙花具有高度自交性,傳粉類群中僅有1種盜粉者。鳳仙花的傳粉者種類豐富,有熊蜂類、蜜蜂類、天蛾類、蝶類、蠅類、鳥類等,盜蜜者類群主要包括短頭熊蜂、考氏無墊蜂(Amegillacaldwelli)、灰熊蜂(B.grahami)等。蜜蜂類傳粉者在各熱點分布區均有記載,為最廣泛的傳粉者,熊蜂類在歐美、日本、中國有分布,天蛾類和蝶類分布在印度、中國,鳥類在歐美、非洲,盜蜜者主要在中國、日本、東南亞分布。鳳仙花種間的自然坐果率變化范圍較大(8%～90%),這與當地傳粉環境以及植物繁殖特性有關。平均坐果率為48.59%±0.05%,低于平均坐果率的鳳仙花占據多數(56.52%),說明自然條件下野生鳳仙花仍然普遍存在傳粉限制,且10種明確記載為自交不親和的鳳仙花的平均坐果率僅有25.58%,說明鳳仙花的自交親和性對其自然結實具有重要作用(表2)。

表2 鳳仙花屬植物的繁育系統比較

3 討 論

3.1 花部特征和訪花昆蟲

花部特征包括開花式樣和單花特征。菱葉鳳仙花成簇叢生以及同株多花的特性可以提高種群對傳粉者的整體吸引力。同花梗的兩朵單花存在開放時差,這可能是為了避免傳粉者的連續訪花性,提高異交率。該種花色鮮艷具有花蜜報酬,符合蟲媒花特征。三條熊蜂為泛化傳粉者,體型較大,而菱葉鳳仙花的傳粉通道較短(8.41 mm),使得花粉落置于其頭部,而同城分布的其他同屬植物的花粉一般落置于其背部,這樣的位置分化在一定程度上緩解同域物種之間的花粉競爭[38]。該植物單花壽命為5 d左右,花性分配比(雌性期/雄性期)為0.98,高于側穗鳳仙花(I.lateristachys)和匍匐鳳仙花(I.reptans)[8],說明菱葉鳳仙花的雄性投入低于部分同屬植物,授粉程度、傳粉者訪問頻率等均會影響該指標[33]。

菱葉鳳仙花主要訪花昆蟲為三條熊蜂、中華蜜蜂、小豆長喙天蛾、蝴蝶等,盜蜜者為短頭熊蜂,存在夜間傳粉者。與國內其他鳳仙花研究相比,菱葉鳳仙花的傳粉者種類較為豐富,可能是由于本研究地點位于峨眉山山腰,為低海拔至高海拔的過渡帶,傳粉者多樣性較高。因為不同海拔傳粉動物一般不同,比如熊蜂因具有較強的體溫調節機制常現于高海拔,而蜜蜂常見于低海拔地區[39]。蜂類訪花者訪花時間較為固定,8∶00至17∶00為主要訪花時段。三條熊蜂的訪花停留時間短于中華蜜蜂,可能是由于前者的口器(19.67 mm,往年觀測數據)偏長于蜜距(18.14 mm),導致取蜜難度較低,花平臺較小難以支撐熊蜂較重的體型,加之菱葉鳳仙花的花蜜體積偏低(2.19 μL),所以其停留時間較短。而中華蜜蜂因其口器較短,難以獲取花蜜,且大多還存在盜粉行為,所以停留時間較長。小豆長喙天蛾作為外來物種,其出現可能與峨眉山發達的旅游業有關。在印度、湖南等均有天蛾在夜間訪花的現象[6,25],而本研究僅在日間觀察過天蛾訪菱葉鳳仙花,但通過夜間開放授粉實驗可知菱葉鳳仙花也可能存在夜間訪花者。蝴蝶常出現在陽光充足的晴天,然而蝴蝶和天蛾常常不被認為是有效傳粉者[34]。經前期調查,菱葉鳳仙花原生地和引種地的傳粉者類群差異不大,但引種地短頭熊蜂盜蜜者更多,蟲害現象更嚴重,生存環境更嚴峻,野生種群的繁育系統待進一步調查,但因本文研究目的重在引種馴化野生菱葉鳳仙花,因此對田間種群中的傳粉者進行調查對后續研究更具實際意義。

3.2 花粉胚珠比、雜交指數和繁育系統實驗

P/O和OCI是測定植物異交率的間接方法。菱葉鳳仙花的P/O結果顯示該種為專性異交,而OCI和人工授粉實驗結果顯示,該植物為兼性異交,因此依據P/O值判斷為專性異交的結果并不完全準確。不去雄套袋實驗顯示該植物具有低比率的自動自交能力,這可能是因為菱葉鳳仙花雌蕊在花蕾期就已經具有可授性,有自動自交的趨勢[30],也可能是因為其他媒介(如螞蟻)形成的誤差。人工授粉并未顯著提高自然坐果率,可能與傳粉者較豐富有關,比如Sreekala[25]研究發現,夜間傳粉者對某些鳳仙花自然坐果具有重要作用。菱葉鳳仙花鮮艷的花部特征、極高的P/O值表示其為典型的異交植物,但異交受環境的影響極大,其蔭蔽的生境和峨眉山多變的天氣可能會導致傳粉者限制,因此該植物自交親和。Escaravage等[40]對高山植物傳粉研究發現,高山昆蟲多樣性低,傳粉者少,因此很多異交植物有向自交進化的趨勢。

3.3 鳳仙花屬植物繁育系統

植物繁育系統的廣義范疇包括生殖、生殖前傳粉、傳粉者行為以及無性克隆等,對植物繁育系統的了解是認識植物生活史的前提,也是其他相關研究的基本背景知識[3,41]。由于性別系統的不同,植物常常表現出多樣化的繁育系統類型。對36種鳳仙花屬植物繁育系統的分析發現,大部分鳳仙花為混合式交配系統,它們大多生活在潮濕蔭蔽的環境,各種類之間自然坐果率和傳粉者種類的變化較大。鳳仙花的混合式交配系統可能與其生境類型有關。在野外蔭蔽環境中,大多鳳仙花可能會面臨傳粉限制,因為傳粉者更偏愛在陽光充分的環境下訪花,蜜蜂活動會受溫度調控,其視覺反應也與光敏感度和紫外光反射有關[39,42]。當傳粉者稀少時,鳳仙花通過高雄性投入提升花部吸引力來吸引傳粉者,因此大多野生鳳仙花顏色鮮艷、造型奇麗,比如Trunschke等[43]對細距舌唇蘭(Platantherametabifolia)林間種群和草地種群的研究發現,林間種群的植物更高、花觀賞性更強、傳粉限制更嚴重。自然坐果率較大的變異性可能與時空異質性、傳粉者多樣性、植物自身交配系統特性等因素相關。

混合式交配系統既是植物在適宜環境下提高后代遺傳多樣性和適合度的機制,也是惡劣環境中的生殖保障,鳳仙花大多為一年生植物,很難形成永久的種子庫,須靠異交擴展種群,自交維持種群[30,44]。鳳仙花中有不少維持異交的機制,比如雄蕊先熟特性、異交系植株提高開花質量減少開花數量的特性等[45]。異交還可以提高胚珠受精率[46],產生的種子更健康,傳播距離更遠[45,47]。但如果僅依靠異交,鳳仙花很難維系種群。比如本文搜集的10種自交不親和的鳳仙花,其平均坐果率僅為25.58%,這說明自交親和性對鳳仙花自然結實具有重要作用。鳳仙花的自交機制包括自動自交、同株異花授粉等。部分鳳仙花的雌蕊在花蕾期就有很強可授性,具有自動自交的趨勢,雖然該屬具有嚴格的雄蕊先熟異交機制,但同株異花授粉依然會引發自交,維持混合式交配系統[3]。另外,傳粉者的泛化性常引起異交結實率的低下,因此自交也是植物應對花粉競爭的重要機制[3]。總之,植物混合式交配系統是動態的,生理機制隱性的自交不親和機制指出,當異花花粉大量存在時,植物會極大限制同株花粉的生殖率,促進異交,而當傳粉資源缺乏時,植物會加大雄性投入或者啟動自動自交和營養繁殖作為繁殖補償機制[3]。因此,混合式交配機制可能是鳳仙花植物面對多變的環境影響形成的生殖策略,自交和異交的交配機制是其長期演化形成的有效繁殖機制。

綜上,大部分鳳仙花屬植物為混合式交配系統,以異交為主,自交親和,與環境影響密切相關,故在該屬植物的傳粉生態學研究、入侵種防控和新品種選育方面需要考慮其繁育系統的影響。然而本文研究內容仍有不足之處,比如在鳳仙花屬整體繁育系統的研究中,不同文獻中的年份、實驗方法和判斷標準均可能對結果產生誤差。在菱葉鳳仙花繁育系統研究中,花粉活力、柱頭可授性等指標尚待研究,且目前研究主要針對菱葉鳳仙花的人工種群,其野外自然種群的情況還需要進一步調查。

致謝：感謝盧焱茜同學為野外實驗工作提供的幫助!