外周血T淋巴細胞亞群的表達變化與急性髓系白血病患者復發風險的關系

牛靜靜，薛 燕，楊 潔

三門峽市中心醫院檢驗科，河南 三門峽 472000

急性髓系白血病（AML）屬血液系統惡性腫瘤，腫瘤細胞通常起始于尚未分化為白細胞的骨髓細胞，或者其他類型的造血細胞，表現為原始的腫瘤細胞大量增生，引起外周血的異常改變［1］。其主要癥狀有貧血、出血、感染、全身肝脾和淋巴結腫大等，目前，主要通過化療或移植控制疾病，達到緩解狀態后，仍舊有較高的復發風險，其根本原因是仍有微小病灶的殘留。復發后的疾病治療起來更加棘手，因此最大程度的清除微小病灶可大大提高患者生存率，延長緩解期［2-3］。基于目前腫瘤免疫治療的研究如火如荼，有研究報道［4-5］，細胞免疫功能直接關系到血液系統腫瘤疾病的形成、發展和預后，在這之中，T 淋巴細胞作為關鍵的免疫細胞，受病原體的刺激后可產生細胞毒T細胞，該細胞可特異針對腫瘤細胞發揮免疫作用。然而，現罕有報道指出T淋巴細胞亞群參與AML 疾病的作用，對疾病的發生發展和預后的聯系仍未明確。因此，本研究將選取健康人群、AML 復發患者及未復發患者為研究對象，探討T 淋巴細胞亞群在不同人群間的分布，并進一步闡述其對預測復發所帶來的作用，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016 年4 月—2018 年4 月三門峽市中心醫院收治的100 例急性髓系白血病患者病歷資料，作為初診AML 組，該組男45 例，女55 例，平均年齡（28.31±5.28）歲；同時選取同時期正常體檢的20名健康人，作為健康人群組，該組男11例，女9例，平均年齡（28.66±5.88）歲。兩組患者一般資料具有可比性（P＞0.05）。納入標準：（1）在醫院首次確診為AML。（2）發病時間在1 周以內。（3）排查其他惡性腫瘤的可能。排除標準：（1）病程超于一星期。（2）多臟器衰竭。（3）妊娠期婦女。（4）既往接受過其他治療。（5）長期免疫抑制劑治療。

1.2 方法

AML患者均給予誘導方案治療，依據患者病情程度及自身承受能力范圍進行個性化選擇，并于骨髓抑制期進行血常規監測，輸注血制品，以及配合抗菌藥物使用。所有研究對象進行外周血T淋巴細胞亞群檢測，空腹時抽取3 mL靜脈血，確保2 h前不服用任何藥物的情況下采血。將乙二胺四乙酸加入血液標本，防止沉淀物析出。吸取100 μL血液置于流式檢測管，再向其加入20 μL 單克隆抗體，于黑箱內37 ℃孵育15 min。取出流式檢測管，向其加入2 mL紅細胞裂解液，混勻后置于黑箱內37 ℃孵育10 min，用3 000 r/min 的轉速將血清分離10 min，得到血清放置于-20 ℃恒溫箱中保存，所有血液標本狀態均無出現黃疸、溶血。除去上清液，加入PBS 液洗滌，沖洗3 次后，加入500 μL PBS 溶液混勻，放入流式分析儀檢測CD3+、CD4+及CD8+，計算CD4+與CD8+比值。

1.3 觀察指標

比較初診AML 組和健康人群組外周血T 淋巴細胞亞群水平；以2018 年4 月—2021 年4 月內是否復發為依據，將初診AML組分為對照組（未復發和完全痊愈病例）和復發組。其中對照組63 例，復發組37 例。統計并比較兩組患者平均年齡、病程、疾病遺傳史例數、以及治療前后外周血T 淋巴細胞亞群水平及差值；使用COX 回歸分析探究外周血T淋巴細胞亞群的表達變化與AML 患者復發風險之間的相關性。

1.4 療效及復發判定標準

（1）復發標準。指骨髓中原始細胞或病變細胞數量為總細胞數量的5%以上，和（或）發現病變范圍超過骨髓。（2）完全痊愈標準。Ⅰ：AML臨床癥狀消失；Ⅱ：骨髓中原始細胞或病變細胞數量低于5%；Ⅲ：奧式小體復查發現不存在；Ⅳ：脫離紅細胞輸注；Ⅴ：凝血功能正常，無白血病細胞；Ⅳ：髓外無病變細胞。（3）未復發標準。較上一次檢查而言，髓內原始細胞比例下降50%以上。

1.5 統計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗。計數資料以例數和百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初診AML 組和健康人群組外周血T 淋巴細胞亞群水平情況

初診AML 組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群組，CD8+水平顯著高于健康人群組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 初診AML組和健康人群組外周血T淋巴細胞亞群水平情況（±s）

表1 初診AML組和健康人群組外周血T淋巴細胞亞群水平情況（±s）

組別初診AML組（n=100）健康人群組（n=20）t值P值CD3+（%）49.25±5.36 70.94±7.59 15.327 0.001 CD4+（%）28.64±6.35 42.12±5.48 8.850 0.001 CD8+（%）33.76±8.12 27.84±7.03 3.038 0.003 CD4+/CD8+（%0.87±0.21 1.68±0.61 10.622 0.001

2.2 影響復發的單因素分析結果

治療后，復發組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于對照組，CD8+水平均低于對照組，且治療前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值均高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 影響復發的單因素分析結果

2.3 影響復發的COX多因素分析結果

治療前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者獨立復發的危險因素，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 影響復發的COX多因素分析結果

3 討論

多名學者表示［6-7］，80%以上的AML 患者采取IA（去甲柔紅霉素+阿糖胞苷）治療緩解率高，為AML 的救治提供了更佳的選擇。但由于患者因復發使治療更為棘手，病死人數較多。研究指出，二次復發的AML患者體能狀態評分較低，應用標準化療的療效并不顯著，但在早期及時干預未來可能復發的患者，在化療方案的基礎上增加分子靶向藥物，可明顯改善患者的CR率和生存率［8-9］。因此預測復發是高緩解率和長生存期的保障，制定預測復發模型可幫助指導醫師判斷病情，從而制定更規范的診療計劃。

T 淋巴細胞作為參與抗腫瘤免疫的關鍵物質，其數量占比為外周血淋巴細胞的70%。CD3+可將上源受體的信號連續傳導，其數量和功能狀態代表了總T 淋巴細胞亞群水平。根據淋巴細胞的表型和功能的不同，人為將T 細胞分為CD4+和CD8+細胞。CD4+細胞在防控癌癥方面發揮關鍵作用，其與組織相容性復合體結合后具有識別異類細胞的功能，啟動自身防御機制，分泌TNF 殺滅腫瘤，并促進CD8+細胞的生殖，激活其狀態，啟動細胞毒T 細胞效應，發揮特異性免疫機制。觀察CD4+細胞比例的變化不失為判定機體免疫狀態的一種方式，值得關注的是，部分CD4+細胞可分化為Treg 細胞，該類細胞可阻滯以上免疫機制，抑制T淋巴細胞的功能狀態。報道顯示，Treg 細胞可抑制淋巴細胞殺傷活力，與腫瘤免疫無能息息相關。另外，CD3+細胞是T 細胞亞群整體數量的反映，其水平的減少提示整體免疫功能將有所下降。CD8+細胞同樣具有調控腫瘤免疫機制的能力，可產生穿孔素，或是激活凋亡機制，影響腫瘤細胞的生命力。與此同時，CD8+細胞也可抑制CD4+細胞的激活、繁殖，因此各細胞可通過自身監控來維持數量和比例，保證免疫機制的各種功能正常運行。CD4+/CD8+值的波動幅度直接影響抗腫瘤免疫的能力，二者細胞的比例失衡可促進腫瘤細胞的種植，縮短患者的生存期。

研究表明，在血液腫瘤患者的血常規中，常出現T 淋巴細胞亞群水平的異常。各細胞數量發生改變，則會引起免疫功能的失調，導致白血病的發生率急速上升。此外，T 淋巴細胞分化抗原在白血病細胞的影響下，表達能力失調，導致病情惡化進一步加重；IL-10 等免疫抑制分子也受白血病細胞的控制，活性大大增加，導致白血病的惡性生物學行為進一步加快。研究結果表示，初診AML 組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均低于健康人群組，CD8+水平顯著高于健康人群組。提示AML 的惡變腫瘤細胞打破了T淋巴細胞亞群的平衡狀態，腫瘤細胞成功“逃逸”，導致T淋巴細胞介導的免疫機制喪失了對其生長的控制。

有報道指出［10］，化療雖存在降低外周白細胞的缺陷，如淋巴系統，但機體可做出一系列適應性變化，如幫助啟動淋巴增值系統的自穩定性功能，增高組織或器官內淋巴細胞數量，使免疫功能得到穩定。化療不僅可殺滅癌細胞，還可抑制腫瘤細胞對免疫功能的破壞能力，使T 細胞亞群的狀態趨于穩定，有利于生理功能的恢復。CD8+水平的上調提示細胞免疫活性將受到抑制，可通過CD4+/CD8+水平的變化得到有效的證實，CD4+/CD8+水平的升高提示免疫功能得到改善。本研究還探討了治療后各細胞數量和比例的變化，結果顯示治療后，復發組CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均高于對照組，CD8+水平均低于對照組。這表示AML患者經規范治療后免疫功能有所上調。如果當CD3+、CD4+及CD4+/CD8+水平均下降后，B 細胞將調控補體的生成機制，促進補體的產生，損傷細胞的正常生理功能。究其原因ALM 患者在脊髓抑制期狀態后，免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸的能力亦下降。但若通過有效的治療，藥物將有效抑制細胞免疫進一步損傷的可能，正如CD4+/CD8+水平升高即可得到提示。研究表明，當CD4+/CD8+水平的提高意味著細胞免疫的正調節點占主導地位，這提示研究者經治療后的AML患者抗腫瘤能力得到了顯著提高。

本文通過單因素分析發現，復發組和對照組治療前后CD3+、CD4+及CD4+/CD8+差值存在明顯差異，提示誘導治療方案可影響細胞免疫功能。研究表明，化療可對細胞免疫有顯著抑制功能。兩組患者治療前T 淋巴細胞亞群水平并無明顯差異，但治療后T 淋巴細胞亞群水平波動較大，說明治療后細胞免疫的變化與復發存在一定聯系。本文通過COX 多因素回歸分析發現，治療前后CD3+差值、CD4+差值、CD8+差值及CD4+/CD8+差值是AML患者獨立復發的危險因素，這表示免疫紊亂的AML患者與預后不佳存在直接聯系，證實治療前后T淋巴細胞亞群的差值是預測AML 危險度的模型，但未來還需更多基礎實驗來驗證該結論。

綜上所述，針對AML 患者，追蹤T 淋巴細胞亞群水平的變化可幫助判斷預后，明確免疫狀態，應用前景廣闊。未來還需再評價在T 淋巴細胞亞群水平在估計療效、判斷微小殘留病灶方面的價值，以制定更佳的治療方案，延長患者生存期。