發酵蔬菜研究進展

趙杰，唐琴麗

賓川縣食品藥品檢驗檢測院（大理 671000）

以蔬菜為原料，經酵母菌、乳酸菌或自然發酵方式發酵而成的蔬菜制品是世界范圍內的傳統發酵食品之一。發酵不僅可以有效保存蔬菜，也可以賦予蔬菜獨特風味及口感，加之其生產方便、成本低廉、原料豐富、促進消化等特點而深受消費者喜愛。但目前大多數發酵蔬菜仍以家庭作坊式生產為主，其潛在的食品安全問題亟待改善。目前，測序及發酵技術日趨成熟，為我們解析自然發酵蔬菜中的有益微生物并通過合成生態系統的方式達到可控的蔬菜發酵提供了技術支持。因此，本文主要從發酵蔬菜的消費、其食品安全及其微生物組成與風味形成等方面進行了概述與討論，以期為發酵蔬菜類食品檢測及開發更加安全、風味多樣的發酵蔬菜提供參考。

1 生產及消費

蔬菜發酵是利用有益微生物的作用，控制一定生產條件對蔬菜進行加工的一種方式。因其兼具保藏及改善風味的功能，蔬菜發酵技術被廣泛應用于世界各地，也因地域、文化等差異，發酵蔬菜品類繁多，風味多樣。具有代表性的有德國酸菜、俄羅斯酸黃瓜、韓國泡菜及中國的四川泡菜、東北酸菜等。根據其工藝不同，發酵蔬菜有腌菜、酸菜、醬菜之分，但其均是不同程度地進行微生物發酵所得的發酵蔬菜類制品，生產方法包括自然發酵和接種發酵兩種。

我國有較長的發酵蔬菜食用歷史，截至目前，根據國家食品藥品監督管理總局統計，我國具備醬腌菜生產許可的企業有4 685家，醬腌菜總產量為405萬 t，總產值超過400億元。在眾多醬腌菜品種當中，榨菜產量最高，約占總產量的1/3。

2 發酵蔬菜食品安全

傳統腌泡菜等發酵蔬菜食品存在許多食品安全問題，如微生物致病菌、致病菌毒素、生物胺等。腌泡菜作為我國一種重要的傳統發酵食品，多以家庭自制自食方式為主，在腌泡菜制作過程中由于原輔料及人為操作原因，極易產生亞硝酸鹽、生物胺等有害物質及蠟樣芽胞桿菌、糞腸球菌等致病菌。

在我國，發酵蔬菜主要存在的質量問題是食品添加劑（苯甲酸、山梨酸、二氧化硫、甜味劑、著色劑）及微生物（主要為大腸菌群）含量超標。近年來食品抽檢結果表明醬腌菜中存在防腐劑混合使用時各自用量占其最大使用量的比例之和，二氧化硫殘留量、苯甲酸、甜蜜素、糖精鈉、脫氫乙酸和鉛含量等不合格項，對醬腌菜食品安全具有較大的影響[1]。醬腌菜中常添加苯甲酸作為抗菌劑以延長產品貨架期，但過量的苯甲酸或擾亂人體的正常代謝，損壞肝臟，甚至造成癌癥。近年來大腸桿菌O157：H7及沙門氏菌等食源性病原菌都在酸性食品中（pH＜4.5）有檢出報道，因此，在發酵類蔬菜產品中，具有低感染劑量及較高酸耐受性的大腸桿菌O157：H7尤其需要注意[2]。

除了食品添加劑所帶來的安全風險外，發酵蔬菜原輔料中的乳酸菌、酵母菌、腸桿菌、葡萄球菌及假單胞菌等微生物通過參與發酵或在儲藏期感染等途徑進入，與游離氨基酸發生脫羧或醛酮的轉氨等反應生成生物胺[3-4]，主要包括組胺、酪胺、色胺、腐胺、尸胺、亞精胺及精胺。生物胺是低分子質量的有機堿，在生物體內發揮重要的生理作用，如胃酸分泌、體溫控制、細胞分化及生長、免疫反應及大腦活動等。但較高的生物胺攝入量會引起頭疼、惡心、呼吸窘迫、嘔吐等癥狀，嚴重的可導致休克，甚至死亡[5]。目前，對于發酵蔬菜中組胺、酪胺、2-苯基乙胺及總生物胺的推薦限量值分別為100，100，30和100～200 mg/kg。據統計，83%的發酵蔬菜中都存在生物胺，韓國泡菜中組胺和腐胺的含量均大于100 mg/kg，我國東北、川渝、北京及臺灣等地區不同種類的發酵類蔬菜中均檢出不同種類的生物胺，且含量較高[6]。但通過添加益生菌菌株，如植物乳桿菌、干酪乳桿菌等可能降低發酵蔬菜中生物胺的形成。

發酵類蔬菜中亞硝酸鹽被認為對人體健康有害，因其與高鐵血紅蛋白血癥及一些胃腸道癌癥有關[7-8]。但研究表明，蔬菜在發酵初期，亞硝酸鹽濃度上升，當pH低于4.5時亞硝酸鹽濃度逐漸下降，直至穩定[9-11]。根據統計數據看，我國各地區發酵蔬菜中亞硝酸鹽含量一般都低于2.0 mg/100 g（以亞硝酸鈉計），符合我國國家食品標準GB 2762—2017《食品安全國家標準食品中污染物限量》規定，并低于世界衛生組織建議的健康成年人每日攝入量[0.06 mg/（kg·d）]。另外，也有試驗結果表明人體中亞硝酸鹽具有降低心血管疾病、心肌梗塞、中風、胃潰瘍、腎衰竭及代謝綜合征等疾病風險的功能[8,12-15]，這說明成熟的發酵蔬菜中基本不存在亞硝酸鹽方面的食品安全問題。但需要注意的是，烹飪或保藏方法會顯著增加產品中硝酸鹽含量[16]，且發酵蔬菜生產過程中鹽、糖、姜及蒜等成分，也可能通過影響發酵過程從而直接或間接地影響硝酸鹽及亞硝酸鹽含量[17]。除亞硝酸鹽外，發酵蔬菜中較高豐度的睪酮、二氫生物蝶呤、鳥苷及胞苷三磷酸鹽等代謝產物會顯著增加胃癌及結直腸癌風險[18-23]。

3 發酵蔬菜中微生物組成及風味物質形成

3.1 發酵蔬菜中微生物組成

發酵蔬菜中有豐富的微生物多樣性，不同發酵蔬菜中微生物群落也不盡相同，但一般以厚壁菌門（Firmicutes）為主，其次為變形菌門（Proteobacteria）、藍細菌（Cyanobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）及放線菌門（Actinobacteria）。其細菌組成以乳桿菌（Lactobacillus）及魏斯氏菌（Weissella）為主[24]，但在發酵過程中，其細菌組成往往是動態變化的，發酵前期及成熟后的發酵蔬菜中優勢細菌組成與生產工藝及原輔料組成息息相關[25]。例如，在一些含鹽發酵蔬菜發酵初期細菌組成主要為嗜鹽細菌及乳酸菌，之后，乳桿菌及乳球菌相對豐度隨發酵時間增加，并最終成為其主要微生物組成，而有些醬腌菜在發酵初期的優勢菌則為魏斯氏菌屬、弧菌屬及片球菌屬等，而發酵中后期則以乳桿菌屬和葡萄球菌屬等為主[26]。在發酵過程中添加大蒜則能有效促進發酵過程中乳酸菌及魏斯氏菌屬生長，而抑制好氧菌的生長[19]。此外，加工設備及人工操作等因素均會影響發酵蔬菜中的細菌多樣性及其組成與功能[27]。

除細菌外，發酵蔬菜中還含有多種真菌。子囊菌門（Ascomycota）是發酵蔬菜中最主要的真菌組成，其次為擔子菌門（Basidiomycota）及擬桿菌門（Phragmoplastophyta）。發酵蔬菜中真菌組成相對穩定，大多數發酵蔬菜中酵母豐度較高，一般以畢赤酵母（Pichia）及有孢漢遜酵母（Hanseniasporan）為主[24]。

發酵蔬菜中微生物種類及數量受季節、成熟度、環境濕度、溫度及殺蟲劑使用等多種因素影響。在發酵過程中，微生物群落多樣性顯著下降，腸桿菌、乳酸菌及酵母等微生物在發酵體系中能存活幾天至幾周不等。乳酸菌因其能產生乳酸導致pH下降，且自身耐酸性較強，往往成為發酵蔬菜中的優勢菌[2]。

3.2 發酵蔬菜中微生物對其風味形成影響

發酵蔬菜風味形成主要由參與發酵的微生物代謝產生的有機酸、游離氨基酸及揮發性物質構成，這些成分與發酵蔬菜中微生物組成密切相關。一般來講，蔬菜發酵主要由乳酸菌主導，其將蔬菜中的糖轉化為乳酸或乙酸，使發酵系統中的pH逐漸降低。在此過程中，微生物組成也隨有機酸、游離脂肪酸及揮發性風味物質產生、分解及轉化而變化。發酵蔬菜中有機酸（乳酸、乙酸）、游離氨基酸（丙氨酸、賴氨酸、谷氨酸）及揮發性物質（醇類、酯類、醛類、酮類）含量相較于發酵初期顯著性增加[26]。Rao等[28]研究了傳統發酵蘿卜中微生物組成與風味間的關系，結果表明乳酸菌屬（Lactobacillus）豐度最高，腸桿菌科（Enterobacteriaceae）次之，前者與4種揮發性風味物質、9種游離氨基酸及1種有機酸這14種風味物質顯著相關，后者則與4種揮發性風味物質、14種游離氨基酸及1種有機酸這19種風味物質顯著相關。乳桿菌（Lactobacillus）及嗜鹽單胞菌（Halomonasspp.）等微生物豐度與有機酸、氨基酸、生物胺及揮發性物質的濃度顯著相關[26]。連續發酵過程中，梭菌屬（Clostridium）、腸桿菌屬（Enterobacter）、乳酸菌屬（Lactobacillus）、魏斯氏菌屬（Weissella）及腸膜明串珠菌（Leuconostoc）等微生物與腌菜中的醇、醛、酯類等揮發性成分呈正相關，而綠膿桿菌（Pseudomonas）、藍藻（Chloroplast）及根瘤菌（Rhizobium）等微生物則與這些揮發性成分呈負相關[29]。魏斯氏菌不僅能增加發酵蔬菜的風味，其產生的酸、醇等代謝產物還能有效抑制病原菌生長，從而保證食品的安全性[30]。發酵完成后，與發酵蔬菜風味顯著性正相關的嗜鹽細菌及乳酸菌的豐度最高，嗜鹽單胞菌、魏斯氏菌及乳酸菌等主要參與發酵蔬菜中丙酮酸代謝及三羧酸循環，使產品具有更高的乳酸及乙酸濃度，嗜鹽細菌及乳酸菌則是發酵蔬菜中氨基酸及脂肪代謝的主要參與者，并合成多種揮發性呈味物質[31]。另外，酵母菌在厭氧條件下進行酒精發酵產生的乙醇與有機酸反應形成酯類物質，對發酵蔬菜風味、質地及產品儲藏周期等指標也有重要的影響作用[32-33]。

生產工藝及原輔料組成的差異對發酵蔬菜中微生物群落組成及風味形成至關重要[25]。例如，含鹽蔬菜發酵過程中，乳桿菌及乳球菌相對豐度隨發酵時間增加，最終成為其主要微生物組成。這使得發酵過程中葡萄糖消耗更加徹底，有機酸及醛醇類揮發性物質含量更高[34-35]。添加大蒜則能有效促進發酵過程中乳酸菌及魏斯氏菌屬生長，同時抑制好氧菌等不良微生物的生長[19]。

4 應用價值

作為全世界普遍消費的一種傳統食品，發酵蔬菜中不僅含有大量微生物、礦物質及纖維素等營養物質[36]，還含有活性肽、短鏈脂肪酸及γ-氨基丁酸等生物活性成分[37-38]。此外，莖根類發酵蔬菜中富含纖維，有利于改善消費者的適口性及消化能力[39]。

盡管發酵蔬菜中存在的多種微生物，但由于乳酸菌在發酵過程中產生大量乳酸及醋酸，使發酵蔬菜pH處于較低水平，最終形成以乳酸菌為主要優勢菌群的微生物群落[40]。此外，其不僅能提升產品的感官質量及延長貨架期，還具有提高消化能力、增加腸道微生物豐度及抗誘變活性、預防糖尿病、增強免疫力、防止細胞損傷及降低膽固醇等功效[32]。因此，發酵蔬菜在功能性食品開發及疾病診斷與治療等方面具有重要應用價值。

近年來，從不同發酵蔬菜中分離出多種具有免疫調節、抗氧化等共能的益生菌株。例如，Mizuno等[41]從腌菜中分離出一株植物乳桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）22 A-3，其能通過腸道表皮細胞影響與過敏相關的巨大細胞，從而達到抑制被動皮膚過敏反應的耳水腫、降低卵白蛋白過敏小鼠血液中IgE及卵白蛋白特異性IgE水平、抑制由2, 4-二硝基氯苯（DNCB）誘導的皮炎等作用。Shankar等[42]從印度Sivakasi地區采集的酸菜中分離得到一株副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei），其產生的胞外多糖具有76.34%的總抗氧化活性、71.15%還原力、68.65%過氧化氫清除活性及60.31% DPPH自由基清除活性，具有較好的抗氧化性應用潛力。Xu等[43-44]從中國東北地區酸菜中分離出一株干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）NA-2，其產生的胞外多糖具有抗生物膜活性、抗氧化及免疫調節活性。馬長路等[45]從自然發酵的傳統東北酸菜中分離獲得的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MHS1701、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）MHS1703、棒狀乳桿菌（Lactobacillus coryniformis）MHS1706的膽固醇脫除率分別達到40.71%，52.84%和41.41%。從四川泡菜中也分離出的一系列具有不同益生功能的乳酸菌，其中發酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）CQPC04、CQPC05、CQPC08具有降脂、抗炎癥因子、改善機體免疫能力及增強機體抗氧化能力等功效[46-48]，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CQPC11可防治由D-半乳糖誘導的氧化及衰老問題[49]。

從發酵蔬菜中分離的乳酸菌除具有醫療保健方面的作用外，其在工業化生產發酵蔬菜方面也具有良好的應用前景。異型發酵乳酸菌可將己糖（葡萄糖及乳糖）轉化為乳酸和乙酸，并產生一些其他風味物質，使相應的產品具有獨特的風味及益生功能。此外，乳酸菌也能產生多種酚類、細菌素及胞外多糖等化合物，這些物質能顯著改善發酵蔬菜的質地、口感及貨架期等特性[50-51]。例如，Lorn等[52]從200株乳酸菌中選出4株具有β-葡萄糖苷酶及乙醇脫氫酶活性的菌株發酵番茄，對發酵番茄中揮發性成分物質檢測結果表明從不同菌株發酵的番茄中共檢測出58種揮發性物質，未經這4株菌株發酵的番茄中富含醛類物質。添加植物乳桿菌發酵的番茄中富含酮類物質，而發酵乳桿菌發酵番茄則富含醇類物質。發酵乳桿菌在發酵過程中展現出較高的乙醇脫氫酶活性，其發酵產品中醛、酮類物質被醇類物質取代，而植物乳桿菌則表現出較低的乙醇脫氫酶活性，但其具有重要的底物選擇多樣性。Le等[53]發現植物乳桿菌發酵芥菜可通過降低IL-6、TNF-α、誘導型一氧化氮合成酶及環加氧酶-2的表達水平等方式顯著抑制一氧化氮產物，從而起到改善芥菜葉抗炎癥活性的作用。因此，相較于傳統的家庭作坊式生產方式，通過對發酵蔬菜中微生物組成的解析開發出具有不同風味及功能的發酵劑，其不僅有利于發酵蔬菜的工業化生產，在消除食品安全隱患方面也具有重要應用價值。

5 結語

發酵作為一種傳統的加工技術，其被廣泛應用于新鮮蔬菜的加工及儲藏。發酵過程中產生的獨特風味物質賦予蔬菜獨特的口感、香味及質地。但目前大多數發酵蔬菜的加工依舊停留在家庭作坊式生產中，其不僅具有不可預測性，還存在各種食品安全隱患。其中，微生物種類及數量是影響發酵蔬菜質量最核心的部分。從目前的研究結果來看，由于發酵蔬菜中微生物組成受原輔料、溫度、地域等多種因素影響，因此不同發酵蔬菜中優勢微生物及呈味微生物不盡相同，而目前在蔬菜發酵開發方面多以單一乳酸菌為主。其雖有利于發酵過程控制，但卻不利于產品的多元化發展，因此，根據不同發酵蔬菜品類以bottom-up策略開發不同蔬菜發酵劑是以后的研究方向。另外，由于發酵蔬菜中存在大量乳酸菌等具有特定功能的微生物，我們也能以此為出發點，篩選并開發具有特定功能的益生菌或其他具有抗菌、抗氧化等功能的菌株，實現資源的多樣化利用。