結(jié)球甘藍黑腐病抗性評價及鑒定方法比較研究

劉霄蕓， 楊志強， 朱運， 彭奧，任雪松， 司軍， 宋洪元， 李勤菲

西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院/重慶市蔬菜學(xué)重點實驗室，重慶 400715

結(jié)球甘藍在我國廣泛種植, 是十字花科蕓薹屬重要的蔬菜作物之一[1]． 黑腐病是為害甘藍生產(chǎn)的主要細菌性病害之一, 病原菌為野油菜黃單胞菌野油菜致病變種(Xanthommonascampestrispv.campestris), 簡稱為“Xcc”[2]． 黑腐病病原菌為水孔侵入, 侵染子葉時呈水浸狀, 然后迅速蔓延至真葉[3]; 侵染真葉時, 病菌多從葉緣侵入, 病斑從葉緣的褪綠斑點逐漸向葉片的主脈擴張, 形成“V”形病斑, 顏色從黃色逐漸變?yōu)楹稚玔3-4]． 黑腐病病菌也可從傷口侵入, 在葉侵染部位形成不規(guī)則的淡褐色病斑[5]． 近年來, 黑腐病在我國甘藍主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生, 直接為害甘藍的葉片和葉球, 對甘藍生產(chǎn)造成嚴重為害[6]． 盡管可通過輪作換茬、 噴施藥物防護等方式加強田間管理以預(yù)防黑腐病的發(fā)生, 但通過農(nóng)業(yè)措施防治黑腐病效果微弱且會增加管理成本, 而藥物防治又具有容易產(chǎn)生抗藥性、 增加環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題[7]． 因此, 種植抗黑腐病甘藍品種成為防治該病最經(jīng)濟有效的措施．

黑腐病病原菌有11個生理小種[8-9], 其中,Xcc1和Xcc4是世界上黑腐病發(fā)生的主要生理小種[4, 10-11]． 甘藍中存在少量抗Xcc1的種質(zhì)[12-13], 但是抗Xcc1和Xcc4的資源相對較少[14-15]． 然而, 甘藍的野生種和近緣種中存在大量抗黑腐病的資源． 研究發(fā)現(xiàn), 甘藍野生種Brassicamontana“UNICT5169”和Brassicabalearica“PI435896”高抗Xcc4, 與花椰菜雜種F2的抗性表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳[16]． 埃塞俄比亞芥“NPC-9”抗Xcc1, “PI199947”抗Xcc1和Xcc4, At1g70610標記可以用于其與花椰菜雜種的黑腐病抗性輔助鑒定[10, 15, 17-18]． Bhatia等[19]發(fā)現(xiàn)埃塞俄比亞芥Xcc1和Xcc4生理小種的抗性存在多基因遺傳, 在Brassicaoleracea×Brassicacarinata的小孢子培養(yǎng)后代中, 所有連鎖群為B7和B5的植株均具有對Xcc1的抗性, 連鎖群為B6和B2的雜種后代則具有對Xcc4的抗性, 而缺乏這兩個連鎖群的株系對Xcc4表現(xiàn)為易感． Tongu?等[20]在芥菜中也發(fā)現(xiàn)抗Xcc1和Xcc4的種質(zhì)“A19182”和“A19183”, 其與甘藍的雜種F1和BC1抗Xcc1和Xcc4． 在抗黑腐病甘藍(“SCNU-C-3470”) C08染色體上發(fā)現(xiàn)了抗病基因Bol031422, BR6-InDel標記可用于Xcc6和Xcc7的抗性輔助選擇[14]． 這些豐富的資源和分子標記為甘藍黑腐病的抗性鑒定和改良提供了重要的支撐．

翟文慧[21]曾通過鑒別寄主法對我國11個地區(qū)的十字花科蔬菜黑腐病菌的生理小種分化進行了研究, 發(fā)現(xiàn)我國黑腐病病原菌大部分為Xcc1和Xcc4, 西南地區(qū)的十字花科黑腐病病原菌主要是Xcc1, 但尚未發(fā)現(xiàn)利用分子標記輔助鑒定重慶地區(qū)黑腐病病原菌生理小種的相關(guān)研究． 另外, 抗性鑒定是篩選抗黑腐病材料十分重要的環(huán)節(jié), 甘藍黑腐病抗性鑒定體系主要采用苗期接種法和離體整葉接種法． 針對種子量極少或植株長勢差的材料, 苗期接種法和離體整葉接種法的操作性受限, 可是采用離體葉片滴接法和噴霧法能快速實現(xiàn)甘藍黑腐病的苗期鑒定[22]． 本研究首先采用分子標記輔助鑒定重慶地區(qū)黑腐病病原菌生理小種, 再將其用離體葉片噴霧法接種于30份結(jié)球甘藍材料上[23], 篩選出抗黑腐病的甘藍材料, 然后利用葉片打孔滴接法和打孔噴霧法, 對甘藍黑腐病抗性進行驗證, 以期建立一套高效快捷的甘藍黑腐病抗性鑒定方法, 為甘藍抗黑腐病的種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育提供技術(shù)保障．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種來源

甘藍黑腐病菌(Xanthommonascampestrispv.campestris), 為黃單胞桿菌屬, 甘藍黃色桿菌, 是重慶菌株, 由西南大學(xué)植物保護學(xué)院提供．

1.1.2 甘藍材料來源

由西南大學(xué)十字花科蔬菜研究所提供的30份結(jié)球甘藍材料, 以感病品種“西園四號”作為對照．

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種純化與菌懸液制備

用平板劃線法將甘藍黑腐病菌株接種于NA培養(yǎng)基上, 在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出, 挑選其中的單菌落用平板劃線法再次接種于新的NA培養(yǎng)基上, 置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h, 重復(fù)3次． 挑選最后一次得到的平板上的單菌落轉(zhuǎn)管并封裝, 放置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?進行接種試驗之前, 將封裝保存于-80 ℃冰箱中的甘藍黑腐病菌株取出, 用NA培養(yǎng)液培養(yǎng)并在搖床上搖菌24 h, 后利用血球計數(shù)板將菌株制備成濃度為1.0×108cfu/mL的菌懸液, 放置在4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆肹23]．

1.2.2 整葉噴霧法

于甘藍蓮座期前, 選取30份結(jié)球甘藍和對照植株從里到外數(shù)的第3片葉, 貼上標簽, 其中每份材料選取30個單株, 用于整葉噴霧法鑒定[24]． 在培養(yǎng)架上放置濕毛巾, 將離體葉片置于濕毛巾上, 將提前準備好的菌液裝入噴壺中, 均勻噴施于葉片表面, 然后用塑料薄膜覆蓋, 四周用夾子和磚塊固定, 使其內(nèi)部保持高濕狀態(tài), 防止水分蒸發(fā)． 調(diào)節(jié)接種室內(nèi)溫度至25 ℃, 給予材料最佳的發(fā)病環(huán)境． 每隔2 d觀察一次并拍照, 至葉片完全枯萎時統(tǒng)計病斑大小, 篩選抗性材料．

1.2.3 打孔噴霧法

根據(jù)整葉噴霧法篩選出極端抗黑腐病的結(jié)球甘藍材料, 隨機選取3個單株的3片葉片, 使用直徑1.4 cm孔徑的打孔器在每片葉子上對稱打孔20個, 形成葉盤． 將90 mm培養(yǎng)皿洗凈并墊上濾紙保濕, 每皿放置10個葉盤． 用裝有菌液的噴壺均勻噴施葉盤, 蓋好培養(yǎng)皿, 放置于保鮮盒中, 置于25 ℃接種箱中, 5 d后統(tǒng)計病斑大小．

1.2.4 打孔滴接法

將每片葉片剩下的10個葉盤放置于培養(yǎng)皿中, 使用移液槍滴20 μL菌液于葉片中央． 蓋好培養(yǎng)皿, 放置于保鮮盒中, 置于25 ℃接種箱中, 5 d后統(tǒng)計病斑大小．

1.2.5 抗性鑒定

1) 測量整葉或葉盤長度, 病斑的發(fā)病點到病斑末端的長度, 病斑大小=病斑長度/葉片長度×100%． 同時按黑腐病抗性分級標準[23-25]進行分級．

Ⅰ病情分級標準．

0級: 沒有病斑;

1級: 葉片有黑色枯死點, 無擴展;

3級: 枯死點向外擴展, 25%以下;

5級: 枯死點向外擴展, 25%～50%;

7級: 枯死點向外擴展, 50%～75%;

9級: 枯死點向外擴展, 75%以上．

病情指數(shù)=100×∑(各級病葉數(shù)×各級代表值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級代表值)．

Ⅱ抗性分級標準．

免疫(I): 病情指數(shù) 0.00;

高抗(HR): 0<病情指數(shù)≤11.11;

抗病(R): 11.11<病情指數(shù)≤33.33;

耐病(T): 33.33<病情指數(shù)≤55.55;

感病(S): 55.55<病情指數(shù)≤67.77;

高感(HS): 67.77<病情指數(shù)≤100．

考慮到離體整葉噴霧法發(fā)病條件極端, 需要對其抗性分級標準進行調(diào)整, 以便適應(yīng)株系的真實抗性, 調(diào)整后如下．

免疫(I): 病情指數(shù) 0.00;

高抗(HR): 0<病情指數(shù)≤22.22;

抗病(R): 22.22<病情指數(shù)≤44.44;

耐病(T): 44.44<病情指數(shù)≤77.77;

感病(S): 77.77<病情指數(shù)≤100．

2) 分子標記輔助選擇

重慶本土黑腐菌的分子標記鑒定采用Rubel等[26]以及Afrin等[27]的方法, 略作修改． 其中, Xcc-47R1(1 089 bp)鑒定Xcc1生理小種, XccR3-49(867 bp)和XccR3-52(1 889 bp)鑒定Xcc3生理小種, Xcc1-46R4(462 bp)和Xcc2-46R4(578 bp)鑒定Xcc4生理小種． 甘藍黑腐病抗性采用來自埃塞俄比亞芥的黑腐病抗性標記(Black rot 3, Black rot 6)(本實驗室開發(fā))[28]和甘藍中的分子標記(BR6-InDel[14])進行分子標記輔助選擇． 具體引物信息見表1．

表1 黑腐病標記引物序列

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

本研究所用的t-test和相關(guān)性分析均采用SPSS軟件進行處理．

2 結(jié)果與分析

2.1 黑腐病病原菌分子標記鑒定

前期研究發(fā)現(xiàn)黑腐病的主要流行病原菌是Xcc1和Xcc4生理小種[10], 本研究采用的黑腐菌是重慶本地菌種, 為了明確使用的黑腐病病原菌生理小種, 本研究利用能夠區(qū)分黑腐菌Xcc1(Xcc-47R1, 1 089 bp),Xcc3(XccR3-49, 867 bp; XccR3-52, 1 889 bp)和Xcc4(Xcc1-46R4, 462 bp; Xcc2-46R4, 578 bp)生理小種的分子標記對黑腐菌進行分子標記輔助鑒定． 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 除了Xcc-47R1能夠擴增出約1 089 bp的特異條帶, 其他引物擴增均無條帶, 表明使用的重慶本地黑腐病病原菌是Xcc1生理小種(圖1)．

圖1 重慶黑腐菌生理小種的分子標記鑒定

2.2 利用離體葉片整葉噴霧法鑒定抗黑腐病材料

離體葉片噴霧法是甘藍黑腐病抗性鑒定廣泛使用的方法之一, 本研究首先采用離體葉片整葉噴霧法對30份結(jié)球甘藍材料和對照進行黑腐病抗性鑒定． 為了更有效地篩選出抗黑腐病的結(jié)球甘藍材料, 本研究采用極端抗性篩選法, 對接種后16 d的葉片進行黑腐病發(fā)病情況的統(tǒng)計． 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 2份材料的平均病斑大小低于30%, 3份材料的平均病斑大小介于30%和60%之間, 其余25份材料的平均病斑大小都高于60%． 其中, S18(24.80±19.70%), S18S(28.57±0.01%)和S232(43.18±9.64%)的平均病斑大小顯著小于對照(87.04±18.33%), 其余材料與對照沒有顯著性差異． S18的病情指數(shù)為38.89, 表現(xiàn)為抗病． S18S(55.55), S232(66.67), S23S(71.72), 167(74.91), 165(76.30)和169(76.30)表現(xiàn)為耐病, 其余23份材料與對照一樣為感病材料(圖2、 表2)．

圖2 離體葉片整葉噴霧法篩選出的抗性材料

表2 結(jié)球甘藍黑腐病抗性離體整葉噴霧鑒定

2.3 利用離體葉片打孔法鑒定抗黑腐病材料

盡管采用離體葉片噴霧法, 極端處理16 d可篩選出抗黑腐病的材料, 但是該過程周期長, 所需葉片多, 針對植株少的材料無法準確地鑒定． 因此, 本研究試圖比較打孔噴霧法和打孔滴接法, 快速有效地鑒定出抗黑腐病的材料． 本研究根據(jù)黑腐病極端抗性鑒定結(jié)果, 挑選1份抗病材料(S18)、 1份耐病材料(S232)和2份感病材料(S19、 S22)與對照(西園四號)一起比較離體葉片打孔噴霧法和打孔滴接法的鑒定效果． 每個材料選取3片大小一致的葉片, 每個葉片打孔產(chǎn)生20個葉盤, 其中10個葉盤進行噴霧接菌, 10個葉盤進行滴接接菌, 5 d后統(tǒng)計發(fā)病情況． 滴接法顯示S18(DI=31.11)為抗病, S232(DI=44.44)為耐病, S19,S22和對照均表現(xiàn)高感, 并且打孔滴接法與離體葉片整葉噴霧法病情指數(shù)顯著正相關(guān)(r=0.96,p=0.011)． 噴霧法顯示S18(DI=39.68)和S232(DI=53.97)為耐病, S19,S22和對照均表現(xiàn)高感(圖3、 表3)． 盡管打孔噴霧法無法區(qū)分出抗病和耐病的材料, 但是打孔噴霧法與離體葉片整葉噴霧法顯著正相關(guān)(r=0.97,p=0.006), 與打孔滴接法的病情指數(shù)也顯著正相關(guān)(r=0.99,p=0.002)． 該結(jié)果說明3種方法都能進行黑腐病的抗性鑒定, 打孔滴接法能更準確地區(qū)分抗病材料和耐病材料．

圖3 離體葉片打孔接種鑒定S18的黑腐病抗性

表3 利用打孔法鑒定黑腐病抗性

2.4 黑腐病分子標記輔助鑒定

由于前期研究發(fā)現(xiàn)大量利用埃塞俄比亞芥與甘藍雜交的相關(guān)研究, 本研究篩選出的甘藍種質(zhì)是否含有埃塞俄比亞芥的黑腐病抗性成分尚不明確． 為了探究篩選出甘藍種質(zhì)黑腐病抗性標記, 本研究利用前期從抗黑腐病埃塞俄比亞芥(PI199947和PI199949)中鑒定的抗黑腐病連鎖標記(Black rot 3, 250 bp和Black rot 6, 500 bp)對抗病材料S18的6個后代和耐病材料S232的6個后代以及10個感病甘藍材料進行分子標記輔助選擇． 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 除了埃塞俄比亞芥抗性材料(PI199947和PI199949)外, 其余材料均無目標條帶． 但是, 利用與Xcc6/Xcc7連鎖的分子標記BR6-InDel(抗病條帶724 bp, 感病條帶1 013 bp)進行鑒定, 發(fā)現(xiàn)盡管所有感病材料中均不含有抗性標記, 但是S18的后代中有3個單株只含有抗性條帶, 1個單株含有抗/感條帶; S232 的后代中有1個單株只含有抗性條帶, 4個單株含有抗/感條帶(圖4), 說明該標記可能對于耐病材料能夠進行分子輔助選擇, 但是無法區(qū)分抗病和耐病材料． 該研究結(jié)果表明S18的黑腐病抗性可能不同于埃塞俄比亞芥, 需要開發(fā)新的分子標記．

從a-c分別是引物Black rot 3、 Black rot 6和BR6-InDel的分子標記; M: marker; 1-6: S18的后代; 7-12: S232的后代; 13: PI199947; 14: PI19949; 15-24: 感病甘藍圖4 S18和S232后代的黑腐病抗性分子標記輔助鑒定

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

3.1.1 結(jié)球甘藍黑腐病抗性鑒定

本研究利用黑腐菌噴施離體整葉極端處理16 d后篩選出抗黑腐病材料1份(S18), 耐病材料6份(S18S, S232, S23S, 165, 167, 169)． 選取1份抗病(S18)、 1份耐病(S232)和2份感病材料用于比較離體葉片打孔滴接法和噴霧法, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 打孔滴接法可快速進行結(jié)球甘藍的黑腐病抗性鑒定, 篩選出抗黑腐病的材料．

3.1.2 結(jié)球甘藍黑腐病分子標記輔助選擇

本研究采用分子標記進行黑腐菌PCR鑒定, 發(fā)現(xiàn)重慶本土菌種為Xcc1生理小種． 抗病甘藍材料不含有埃塞俄比亞芥黑腐病抗性連鎖標記(Black rot 3和Black rot 6), 但是在抗病和耐病甘藍后代中均存在BR6-InDel標記．

3.2 討論

要建立高效的甘藍抗病性篩選鑒定方法, 既要符合田間發(fā)病期病原菌的適宜發(fā)病環(huán)境, 也要考慮甘藍植株自身生長狀況與抗病性關(guān)系; 并要進行接種鑒定選用致病力較強的病原菌, 在甘藍幼苗的旺盛生長期進行接種試驗, 才能真實地表現(xiàn)出甘藍資源的抗感性能． 對黑腐病抗性鑒定常用接種方法有幼苗期噴霧接種、 幼苗期剪葉接種、 針刺接種、 葉脈接種、 水孔接種、 吐水法和離體葉片法等10余種接種方法[29]． 不同的接種方法, 由于葉片侵染時的狀態(tài)、 環(huán)境溫濕度的不同, 造成發(fā)病時間呈現(xiàn)較大的差異． 種子侵染接種較受國外學(xué)者青睞, 但此法條件難以控制, 受影響因素也較多． 陳果等[30]采用幼苗期噴霧接種, 發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)材料的抗病性鑒定結(jié)果與田間抗性鑒定結(jié)果一致, 但種質(zhì)種子量較少的情況下該方法不適用． 幼苗期剪葉接種和噴霧接種使病原菌在水孔處繁殖, 通過水孔侵入, 不僅能鑒定寄主抗擴展能力, 還能反映抗侵入特性, 較剪葉法更能全面地反映寄主所具有的抗病性, 但常出現(xiàn)菌體不能進入水孔的現(xiàn)象, 造成感病品種也不發(fā)病． 吐水法接種可以避免漏接現(xiàn)象, 而且鑒定結(jié)果較為準確, 但費時費力, 接種難度比較大[24]． 離體葉片接種易操作, 不受季節(jié)時間限制和外界環(huán)境影響, 但發(fā)病時間較長． 王超等[31]在甘藍黑腐病研究中對比了5種接種方法, 認為離體剪葉法更適用于甘藍黑腐病的苗期鑒定． 本研究首先采用離體整葉噴施法進行極端處理, 這種方法可同時篩選多份材料, 在不損傷葉片的情況下得到的結(jié)果也更符合甘藍的田間栽培環(huán)境, 篩選出的一定為抗黑腐病材料, 但是該方法耗時長, 工程量大, 篩選出來的結(jié)果比較極端, 可能會篩掉一部分高抗和耐病品種． 因此, 在總結(jié)以上接種方法后, 本研究篩選出了一套簡單迅速且鑒定準確的甘藍黑腐病抗性鑒定方法——打孔接種法, 分別為打孔噴霧接種法和打孔滴接法． 兩種接種方法統(tǒng)計時間一致, 共性在于同一方法不同材料之間的發(fā)病狀況差異均較大, 可以明顯比較不同材料抗病性大小; 而兩種方法之間平行比較存在發(fā)病狀態(tài)的差異． 在葉片破壞程度與葉片自身抗性等同的情況下, 打孔噴霧法相較于打孔滴施法發(fā)病更快, 但是這兩種方法與整葉噴霧法的發(fā)病趨勢均一致． 接種5 d后統(tǒng)計發(fā)病情況, 打孔滴接法能區(qū)分抗感材料; 打孔噴霧法可能適合提前統(tǒng)計． 因此, 采用離體葉片打孔滴接法接種5 d后進行黑腐病發(fā)病情況的統(tǒng)計, 可快速并可靠地進行結(jié)球甘藍的黑腐病抗性鑒定．

挖掘和篩選抗源材料是開展甘藍黑腐病育種工作的基礎(chǔ), 國內(nèi)外許多育種工作者已經(jīng)在抗源篩選及新品種的選育上取得了一定的進展[32]． 但由于黑腐病生理小種分化較為復(fù)雜, 單個抗性品種/品系并不能為Xcc所有的生理小種提供抗性． 因此, 在分子水平上正確鑒定Xcc小種抗性位點對于黑腐病抗性育種以及利用現(xiàn)有抗性種質(zhì)是必要的． 本研究利用Xcc1(Xcc-47R1, 1 089 bp),Xcc3(XccR3-49, 866 bp; XccR3-52, 1 888 bp)和Xcc4(Xcc1-46R4, 462 bp; Xcc2-46R4, 578 bp)的分子標記對重慶本土病菌鑒定后, 發(fā)現(xiàn)重慶本土黑腐菌為Xcc1． 研究認為, 十字花科A基因組抗Xcc4, B基因組抗Xcc1和Xcc4[15], 含有BBCC基因組的埃塞俄比亞芥可以同時高抗Xcc1和Xcc4[17]． 近年來, 在甘藍中也發(fā)現(xiàn)了抗Xcc1的種質(zhì)[12-13]． 本研究從甘藍資源中篩選出抗Xcc1的材料, 并利用前期從抗黑腐病埃塞俄比亞芥中篩選出的連鎖標記Black rot 3和Black rot 6, 對篩選出的抗黑腐病甘藍材料后代進行分子標記輔助選擇, 發(fā)現(xiàn)在所有材料中均不含有埃塞俄比亞芥抗Xcc1的抗性位點, 說明這些結(jié)球甘藍存在不同于埃塞俄比亞芥的新Xcc1抗性位點; 該研究對甘藍黑腐病抗性基因的挖掘和抗性改良提供了重要的種質(zhì)資源． Hong 等[14]通過分析油菜芽孢桿菌中157個編碼NBS-LRR的R基因, 篩選到一個可能與Xcc6的黑腐病抗性緊密關(guān)聯(lián)的基因Bol031422, 從而開發(fā)了相關(guān)的InDel標記BR6-InDel, 并且發(fā)現(xiàn)將接種Xcc6或Xcc7獲得的表型結(jié)果與BR6-InDel標記的基因型結(jié)果進行比較, 顯示BR6-InDel標記適應(yīng)性的預(yù)測能力為 83.9%． 本研究將該標記應(yīng)用到篩選出的抗病、 耐病材料后代和感病材料中, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在抗病和耐病材料中均能擴增出抗性條帶, 但是感病材料中無抗性條帶, 說明該標記并不能對S18進行黑腐病的抗性輔助選擇, 但是抗病材料(S18)和耐病材料(S23)可能具有Xcc6或Xcc7抗性．