基于臨床驗方的六金顆粒制備及質量標準研究

羅毅， 秦金淼， 張榮飛， 劉子夜，曹桂云， 姚元成， 孟兆青， 容蓉

1. 山東中醫藥大學 藥學院，濟南 250355；2. 山東省中醫藥治療呼吸系統疾病技術創新中心，濟南 250103；3. 山東宏濟堂制藥集團股份有限公司，濟南 250103

六金顆粒由蒲公英、 忍冬藤、 大青葉、 板藍根、 錦燈籠、 龍脷葉6味藥材組成, 具有清熱解毒、 疏風利咽的功效． 方中蒲公英甘寒, 擅疏風清肺熱, 為君藥; 忍冬藤苦甘寒, 助君藥清熱解毒, 能利尿通淋, 使熱從小便而出, 兼有消腫散結、 利咽化痰之功效, 為臣藥; 大青葉、 板藍根清上焦熱, 尤善清血中之熱, 且能利咽消斑; 錦燈籠清熱利尿通淋; 龍脷葉甘淡潤肺, 避免熱傷肺陰, 同時兼有通便作用, 使熱從大便而出, 共為佐使． 六藥合用, 專于清肺熱, 兼清上中下三焦之熱, 能清氣分、 血分之熱, 使熱從內消、 從二便而解． 本方專于清熱以治病之本, 同時疏風、 利咽消腫、 止咳化痰以解癥之標, 且清熱兼顧護陰, 使邪去而不傷正． 基于該處方良好的臨床應用實踐, 可進行中藥新藥的開發． 本研究對該方劑制備工藝反復優化確定其參數并對制劑進行質量標準研究．

君藥蒲公英為菊科植物蒲公英、 堿地蒲公英或同屬數種植物的干燥全草, 含有多種成分, 可分為三萜類、 黃酮類、 倍半萜內酯類、 植物甾醇類、 香豆素類、 色素類、 酚酸類、 脂肪酸、 揮發油、 胡蘿卜素類等． 臨床藥理研究蒲公英具有顯著的廣譜抑菌、 抗病毒及免疫調節等作用[1-2], 與六金顆粒功能主治相關． 通過前期對六金顆粒制劑物質基礎分析, 菊苣酸為蒲公英中的專屬性成分, 在制劑中與其他化合物相比含量較高． 菊苣酸是一種羥基肉桂酸, 分子式為C22H18O12, 現有文獻報道證明其對呼吸道合胞病毒、 單純皰疹病毒等多種病毒以及金黃色葡萄球菌、 結核分歧桿菌等不同致病細菌具有顯著的抑制活性[3-4]． 本研究選擇與制劑藥效相關的活性成分作為定量評價六金顆粒質量的指標．

1 試驗方法

1.1 儀器與藥材

1.1.1 儀器

試驗所用儀器主要有: Aglient 1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司), BSA224S-CW電子天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司), XS-105電子天平(梅特勒托利多科技(中國)有限公司), LPG-8精密藥用噴霧干燥機(山東精誠醫藥裝備制造有限公司), GFL25P干法制粒機(山東精誠醫藥裝備制造有限公司)以及KQ800VSM雙頻靜音型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)．

1.1.2 藥材

蒲公英(購自洛寧益民藥材藥種購銷站, 批號: YF22100012)、 忍冬藤(購自河北一仁藥業有限公司, 批號: 21030011)、 大青葉(購自安國市世元商貿有限公司, 批號: YF21040002)、 板藍根(購自山東興泰中藥材有限公司, 批號: 21090014)、 錦燈籠(購自河北一仁藥業有限公司, 批號: YF21030001)、 龍脷葉(購自河北一仁藥業有限公司, 批號: YF21030003)等藥材經山東省食品藥品檢驗研究院林永強鑒定, 均符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部規定．

麥芽糊精(購自長嶺吉隆生物藥業有限公司, 批號: 2010001)、 甜菊糖苷(購自曲阜圣仁制藥有限公司, 批號: 22072102)、 菊苣酸對照品(純度: 99.1%, 批號: 11752-202104, 購自中國食品藥品檢定研究院)、 酸漿苦味素L對照品(供薄層鑒別用, 批號: 111831-201903, 購自中國食品藥品檢定研究院); 乙腈和甲醇為色譜級, 均購自月旭科技(上海)股份有限公司; 無水乙醇購自天津市富宇精細化工有限公司; 磷酸購自天津市科密歐化學試劑有限公司．

1.2 方法

1.2.1 六金顆粒的制備

蒲公英、 忍冬藤、 板藍根、 大青葉各600 g, 錦燈籠、 龍脷葉各150 g, 加水煎煮2次, 第1次1 h, 第2次0.5 h, 合并煎液, 濾過, 濾液濃縮至相對密度1.09～1.11(60 ℃), 濾過, 噴霧干燥, 噴干粉過100目篩, 加入甜菊糖苷和麥芽糊精適量, 制粒, 制成1 000 g, 即得．

1.2.2 顆粒評價指標的測定方法

采用成型率、 堆密度和休止角3個指標來評價顆粒的質量, 以及顆粒吸濕性和水分含量, 以上5個指標綜合評價輔料的選擇以及制劑的成型工藝[5-8]．

成型率測定方法． 將六金顆粒稱質量, 先過1號篩, 再過5號篩, 能過1號篩但不能通過5號篩的顆粒作為合格顆粒, 收集并稱質量, 顆粒的成型率=(合格顆粒質量/過篩前顆粒質量)×100%．

堆密度測定方法． 采用量筒測定法, 稱取制得的顆粒10 g, 放入干燥的25 mL量筒中, 記錄其體積(mL), 堆密度值(g/mL)=10/c． 重復測定5次, 取平均值．

休止角測定方法． 采用固定漏斗法, 3只漏斗串聯后, 將其固定于水平放置的坐標紙上高1.5 cm的位置(H), 將六金顆粒沿漏斗壁緩慢地倒入最上面的漏斗中, 直到坐標紙上形成的顆粒圓錐尖端可以接觸到漏斗口, 測算顆粒底部的直徑(2R), 計算休止角tgα=H/R． 重復測定3次, 取平均值．

吸濕性測定方法． 精密稱定本品顆粒2 g, 平行3份, 置于干燥器中25 ℃恒溫平衡48 h, 將底部放置氯化鈉過飽和溶液, 此時干燥器內相對濕度為75%． 于24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h, 168 h后稱質量, 計算吸濕百分率． 吸濕百分率=(吸濕后顆粒質量-吸濕前顆粒質量)/吸濕前顆粒質量×100%． 吸濕二項式方程:W=2at+bt+c, 其中W表示吸濕量,t表示時間．

水分測定方法． 取制得的顆粒2～5 g, 各3份, 采用烘干法測定．

2 結果與分析

2.1 處方中輔料的篩選

2.1.1 噴干粉與輔料比例考察

稱取噴干粉平均分為5份, 分別按照藥輔比1∶0.25加入相應輔料, 混合均勻, 制粒． 以過篩情況、 顆粒成型率、 流動性及溶化性為考察指標, 優選最適合的輔料, 結果見表1．

表1 輔料種類篩選

由表1可知, 在成型工藝中, 除乳糖外, 其余4種輔料均可制粒, 但可溶性淀粉和玉米淀粉組制粒過篩時細粉較多, 成型率低于糊精和麥芽糊精組; 以麥芽糊精制粒成型率和流動性均優于以糊精制粒, 并且以糊精制粒后用熱水溶解, 有明顯白色沉淀, 因此本品選擇麥芽糊精為輔料進行制粒．

稱取噴干粉平均分成3份, 分別加入不同量的麥芽糊精, 混合均勻, 制粒． 以過篩情況、 顆粒成型率、 流動性及顆粒水分為考察指標, 優選麥芽糊精的用量, 結果見表2．

表2 輔料用量篩選

由表2可知, 成型工藝中, 3個藥輔比過篩情況一致, 均為已過篩可制粒; 藥輔比為1∶0.25和1∶0.30的成型率及流動性優于1∶0.20, 并且藥輔比為1∶0.25和1∶0.30顆粒水分含量低于1∶0.20; 藥輔比1∶0.25和1∶0.30兩組間的成型率、 流動性及顆粒水分含量差異小, 因此基于輔料添加最小量原則, 選擇噴干粉∶麥芽糊精比例為1∶0.25作為制粒的輔料添加量．

2.1.2 矯味劑的篩選

為對顆粒進行矯味, 針對三氯蔗糖、 甜菊糖苷和阿斯巴坦3種矯味劑種類及用量進行了口感打分評價, 由50名健康實驗員進行打分, 結果表明, 添加5‰甜菊糖苷作為矯味劑的顆粒評分最高, 因此選用5‰甜菊糖苷作為矯味劑(表3)．

表3 不同矯味劑及用量

2.1.3 中試工藝驗證

連續3批六金顆粒中試生產, 采用干法制粒, 根據藥輔比1∶0.25加入麥芽糊精, 加入5‰甜菊糖苷作為矯味劑, 制粒后分單包裝． 按照《中國藥典》2020年版四部顆粒劑相關檢查項對其進行檢查． 3批次六金顆粒粒度均勻, 顆粒顏色由黃棕色至深棕色; 按照要求, 能通過一號篩但不能通過五號篩的顆粒及粉末所占百分比<15%符合標準, 3批次顆粒成型率為97.3%～98.5%, 符合規定; 休止角代表顆粒流動性, 一般認為休止角≤30°表明流動性良好, 3批次顆粒休止角在16.8°～18.0°, 表明顆粒流動性良好; 堆密度、 溶化性和水分均符合規定(表4)．

表4 六金顆粒3批次中試工藝驗證生產結果

吸濕性檢測7個時間點, 每24 h檢測一次, 于24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h, 144 h和168 h分別測定顆粒的吸濕性, 并計算各時間點的吸濕率(表5)． 測定結果表明, 3批次中試驗證生產的六金顆粒吸濕擬合回歸曲線方程為y=-0.000 92x+0.291 8x-1.219,r2=0.986 5, 擬合程度良好(圖1), 平衡吸濕時間為162.1 h, 平衡吸濕率為24.6%．

圖1 六金顆粒吸濕曲線

表5 六金顆粒3批次中試工藝驗證吸濕率 %

3批次中試規模驗證生產的六金顆粒符合《中國藥典》2020年版四部通則0104顆粒劑項下檢查要求．

2.2 錦燈籠薄層色譜鑒別

2.2.1 供試品溶液的制備

取本品3 g, 研細, 加甲醇25 mL, 超聲處理30 min, 過濾, 濾液蒸干, 殘渣加甲醇2 mL使其溶解, 作為供試品溶液．

2.2.2 對照品溶液的制備

取酸漿苦味素L對照品, 加甲醇制成每1 mL含0.1 mg的溶液, 作為對照品溶液．

2.2.3 錦燈籠陰性樣品溶液的制備

取陰性樣品3 g, 按2.2.1方法制備不含錦燈籠的六金顆粒陰性供試品溶液．

2.2.4 鑒別

分別吸取六金顆粒供試品溶液和錦燈籠陰性供試品溶液12 μL, 酸漿苦味素L對照品溶液10 μL, 在同一高效硅膠G薄層板上點樣, 展開劑為三氯甲烷-丙酮-甲醇(25∶1∶1), 展開, 取出, 晾干, 顯色劑為5%硫酸乙醇溶液, 在105 ℃加熱至斑點清晰, 室溫下放置30 min, 置紫外光燈365 nm下檢視． 結果表明, 六金顆粒供試品色譜中, 在與對照品色譜相應的位置, 顯相同黃色的熒光斑點, 陰性樣品在相應位置無黃色熒光斑點, 說明該方法專屬性良好(圖2)．

1: 供試品溶液; 2: 陰性樣品溶液; 3: 酸漿苦味素L對照品溶液圖2 錦燈籠薄層鑒別專屬性試驗色譜

2.2.5 樣品檢測

取不同批次六金顆粒(批號: 2202001, 2202002, 2202003), 按照“2.2.1”的方法制備供試品溶液, 按照“2.2.4”的方法進行鑒別． 結果表明, 3批六金顆粒供試品色譜中, 在與對照品色譜相應位置上, 顯相同黃色的熒光斑點(圖3)．

1: 供試品溶液(2202001); 2: 供試品溶液(2202002); 3: 供試品溶液(2202003); 4: 酸漿苦味素L對照品溶液圖3 3批樣品錦燈籠薄層鑒別色譜

2.3 蒲公英含量測定

2.3.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(4.6 mm×250 mm, 5 μm), 以乙腈-0.4%磷酸溶液(18∶82)為流動相, 檢測波長為327 nm, 理論板數按菊苣酸峰計算應不低于5 000．

2.3.2 對照品溶液制備

取菊苣酸對照品適量, 精密稱定, 加50%甲醇制成每1 mL含30 μg的溶液, 即得．

2.3.3 供試品溶液制備

取裝量差異項下的本品, 混勻, 研細, 取約0.5 g, 精密稱定, 置于具塞錐形瓶中, 精密加入50%甲醇25 mL, 稱定重量, 超聲處理(功率250 W, 頻率40 kHz)30 min, 放冷, 再稱定重量, 用50%甲醇補足減失的重量, 搖勻, 濾過, 即得．

2.3.4 蒲公英陰性供試品溶液的制備

取不含蒲公英的六金顆粒1.0 g, 精密稱定, 按“2.3.3”項下方法制成蒲公英陰性供試品溶液, 即得．

2.4 蒲公英含量測定方法學考察

2.4.1 專屬性

取菊苣酸對照品溶液、 六金顆粒供試品溶液、 蒲公英陰性供試品溶液各10 μL, 注入高效液相色譜儀, 按照“2.3.1”色譜條件進行樣品檢測． 結果表明, 在供試品色譜中, 在與對照品色譜相應的保留時間上有相同的色譜峰, 而蒲公英陰性供試品溶液無相應色譜峰; 表明處方中其他藥材及輔料對菊苣酸含量測定結果無干擾, 表明該方法專屬性良好(圖4)．

1: 六金顆粒供試品溶液; 2: 蒲公英陰性供試品溶液; 3:菊苣酸對照品溶液圖4 菊苣酸含量測定方法學專屬性色譜

2.4.2 線性試驗

將濃度為718.28 μg/mL的菊苣酸對照品溶液, 分別稀釋成濃度為1.44 μg/mL, 5.75 μg/mL, 14.37 μg/mL, 28.73 μg/mL, 57.46 μg/mL, 86.19 μg/mL的溶液, 按“2.3.1”項下色譜條件進樣． 以菊苣酸的濃度為橫坐標, 色譜峰面積為縱坐標, 進行線性回歸, 得回歸方程為y=45.196x-6.533 2, 相關系數為r=0.999 9, 菊苣酸在濃度1.44～86.19 μg/mL范圍內, 線性關系良好．

2.4.3 重復性試驗

取六金顆粒(批號: 2201001)平行制備6份供試品溶液, 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.3.1”項下色譜條件測定菊苣酸的質量分數, 得到菊苣酸的平均質量分數為1.28 mg/g, RSD為0.64%, 表明該方法重復性良好．

2.4.4 中間精密度試驗

取六金顆粒(批號: 2201001), 由不同分析人員按“2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液, 按“2.3.1”項下色譜條件采用不同儀器進行菊苣酸質量分數測定． 結果表明, 不同儀器的RSD為0.70%, 說明該方法所用儀器精密度良好．

2.4.5 穩定性試驗

分別于第0 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h進樣測定同一六金顆粒供試品溶液(批號: 2201001), 計算菊苣酸的質量分數, 結果表明, 菊苣酸平均質量分數為1.30 mg/g, RSD為1.54%, 表明供試品溶液在72 h內穩定性良好, 均符合分析要求．

2.4.6 回收率試驗

取六金顆粒6份, 分別加菊苣酸對照品溶液適量, 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.3.1”項下色譜條件測定菊苣酸的質量分數, 并計算加樣回收率． 結果表明, 菊苣酸回收率為97.98%～101.32%(表6), RSD為1.36%, 符合分析要求．

表6 回收率試驗結果

2.5 HPLC特征圖譜

2.5.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Waters Atlantis T3, 4.6 mm×250 mm, 5 μm); 以甲醇為流動相A, 以0.2%磷酸為流動相B, 按表7的規定進行梯度洗脫; 檢測波長為320 nm, 柱溫為35 ℃． 理論板數按單咖啡酰酒石酸峰計算應不低于3 000．

表7 梯度洗脫表

2.5.2 對照品溶液制備

精密稱取單咖啡酰酒石酸對照品, 加入50%甲醇, 制成每1 mL含30 μg的溶液, 即得．

2.5.3 供試品溶液制備

取裝量差異項下的本品, 混勻, 研細, 取約0.5 g, 精密稱定, 置具塞錐形瓶中, 精密加入10%甲醇25 mL, 稱定重量, 超聲處理(功率250 W, 頻率40 kHz)30 min, 放冷, 再稱定重量, 用10%甲醇補足減失的重量, 搖勻, 濾過, 取續濾液, 即得．

2.6 HPLC特征圖譜方法學考察

2.6.1 重復性試驗

取六金顆粒(批號: 2201001), 按“2.5.3”項下制備供試品溶液, 按“2.5.1”色譜條件測定, 結果表明, 8個特征峰的相對保留時間RSD≤0.61%, 相對峰面積RSD≤1.91%, 該方法的重復性良好．

2.6.2 穩定性試驗

取六金顆粒(批號: 2201001), 按“2.5.3”項下制備供試品溶液, 按“2.5.1”色譜條件分別于0,3,6,12,24,48 h測定, 結果表明, 8個特征峰相對保留時間RSD≤0.45%, 相對峰面積RSD≤1.84%, 供試品溶液在48 h內穩定性良好．

2.6.3 中間精密度試驗

取六金顆粒(批號: 2201001), 按“2.5.3”項下制備供試品溶液, 按“2.5.1”色譜條件測定, 結果表明, 8個特征峰的相對保留時間RSD≤0.85%, 相對峰面積RSD≤2.46%, 使用不同儀器的8個特征峰的相對保留時間RSD≤2.77%, 相對峰面積RSD≤2.57%, 該方法的中間精密度良好．

2.6.4 耐用性試驗

取六金顆粒(批號: 2201001), 按“2.5.3”項下制備供試品溶液, 分別使用Waters Atlantis T3, Waters Xselect T3, Agilent TC-C18(2)不同色譜柱, 按“2.5.1”色譜條件測定, 結果表明, 8個特征峰的相對保留時間RSD≤3.87%, 相對峰面積RSD≤6.91%, 說明該方法適用性良好．

2.6.5 峰歸屬及峰指認

峰歸屬及峰指認結果表明, 峰1化合物未知, 屬于龍脷葉藥材; 峰2化合物未知, 屬于忍冬藤藥材; 峰3化合物為新綠原酸, 屬于蒲公英藥材; 峰4化合物為單咖啡酰酒石酸, 屬于蒲公英藥材; 峰5化合物未知, 屬于忍冬藤藥材和龍脷葉藥材; 峰6化合物為綠原酸, 屬于忍冬藤藥材、 蒲公英藥材、 龍脷葉藥材; 峰7化合物未知, 屬于忍冬藤藥材、 蒲公英藥材、 錦燈籠藥材; 峰8化合物為隱綠原酸, 屬于忍冬藤藥材(圖5)．

圖5 六金顆粒特征圖譜峰指認結果

2.7 樣品測定

取不同批次六金顆粒(批號: 2202001,2202002,2202003), 按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.3.1”色譜條件測定菊苣酸的質量分數, 結果顯示3批樣品中(每袋裝10 g)菊苣酸平均質量分數為1.32 mg/g, RSD為0.44%． 按“2.5.3”項下方法制備供試品溶液, 按“2.5.1”色譜條件測定, HPLC特征圖譜8個特征峰的相對保留時間RSD≤1.02%, 相對峰面積RSD≤3.55%, 結果符合規定．

3 結論與討論

中藥顆粒劑是在中藥湯劑和糖漿等劑型的基礎上發展起來的新劑型, 既保持了湯劑吸收快、 作用迅速的特點, 又克服了湯劑使用時煎煮不便、 服用量大、 易霉變質等缺點, 較之注射劑等能較大程度地保留藥材有效成分, 制備工藝相對簡單, 能適用于工業生產, 劑量小, 服用、 攜帶、 儲藏、 運輸均較方便[9-10], 故在劑型選擇時確定為顆粒劑．

六金顆粒在噴干粉儲存過程中發現物料容易吸濕結塊, 加入輔料可以明顯改善吸濕結塊問題[11]． 本研究選擇中藥制粒工藝中常用的輔料可溶性淀粉、 淀粉、 麥芽糊精、 糊精和乳糖[12]進行了比較研究． 因本品噴干粉本身吸濕性較強, 因此加入乳糖后增加了其吸濕性, 黏篩網無法進行制粒． 可溶性淀粉和淀粉具有良好的抗濕性, 但是在制粒過程產生的細粉過多, 使得顆粒成型率低． 麥芽糊精和糊精具有良好的成型性, 但糊精的溶化性很差, 形成白色沉淀, 最終選擇使用麥芽糊精降低了噴干粉的水分含量并改善了其吸濕性．

六金顆粒處方中含有錦燈籠, 錦燈籠中主要化學成分為酸漿苦味素類, 使得顆?？诟衅? 影響了患者的順應性． 對三氯蔗糖、 甜菊糖苷和阿斯巴坦3種矯味劑進行了篩選, 除了口感上的比較之外, 還考慮了安全性因素． 阿司帕坦不適用于苯丙酮酸尿患者[13]; 三氯蔗糖會影響腸道微生物群的平衡, 促使炎癥因子的富集[14]; 甜菊糖苷未見不良反應報道, 加之可以有效改善口感, 因此本品選擇甜菊糖苷作為矯味劑．

制劑的活性成分能反應制劑的有效性, 對工藝路線選擇、 成型工藝、 制劑穩定性有監控作用, 故處方制劑中已明確有活性成分的首先選擇活性成分進行質量標準研究, 同時選擇指標時還應重視對制劑質量的可控性, 對于含量低于制劑萬分之一的成分已基本無質控意義[15-16]． 六金顆粒處方有效成分復雜, 蒲公英作為君藥, 具有廣泛的生物活性, 起到清熱解毒功效． 根據“君臣佐使”與藥效活性相結合的原則, 本研究中含量測定指標化合物定為菊苣酸, 采用高效液相色譜法對制劑中的菊苣酸進行含量測定, 對流動相比例反復優化, 最終確定了最優的流動相比例及洗脫梯度, 結果表明該方法易于操作, 重復性良好．

中藥指紋圖譜技術是從中藥整體化學物質基礎角度出發, 對中藥化學成分特征進行系統的、 整體的、 專屬的表征的方法, 具有專屬性強、 穩定性好、 重現性好的特點[17-18]． 六金顆粒采用HPLC法建立了特征圖譜, 通過特征峰的相對保留時間及色譜峰的數量來檢測不同批次間制劑的差異, 可作為制訂前端藥材內控標準的依據．

鑒于中藥成分復雜、 基礎研究薄弱、 生產過程復雜等特點, 質量標準研究難以從全成分檢測和控制上設置相應檢測項目． 《中藥新藥質量標準研究技術指導原則(試行)》[19]提出根據藥品的特點建立專屬性、 針對性的檢查方法建立反映制劑特點的檢查項目, 鼓勵指紋圖譜或特征圖譜應用于中藥這種復雜體系的含量測定, 從而提高質量標準的整體可控性． 本研究目前仍采用較為傳統的藥品質量控制模式[20], 對蒲公英、 忍冬藤等6味藥湯劑轉化為顆粒劑, 進行了制備工藝研究和質量標準研究, 所建立的六金顆粒制備工藝穩定合理可行, 建立的質量標準中薄層色譜鑒別、 含量測定和特征圖譜方法科學、 合理, 能夠多角度地有效控制產品質量, 為后續產品生產及品質評價提供參考依據． 隨著多學科互動協作, 新技術、 新方法, 如質-量雙標法、 譜效關系法、 基于網絡藥理學及代謝組學的質量標志物法等多種模式和手段的應用[18, 21], 將為中藥制劑質量控制研究帶來新的發展思路．