黃芪建中湯對肝纖維化大鼠JAK/STAT信號通路的調節作用研究*

張學政 吳冬冰 張學娟 吳冬寒

三亞市人民醫院消化內二病區 (海南 三亞,572100)

肝纖維化是由各種肝臟疾病引起的肝臟結締組織異常增生的肝臟病理學變化,若不及時進行干預,肝纖維化會進展為肝硬化、肝癌等嚴重肝臟疾病及多組織器官并發癥[1]。由于肝纖維化發病機制復雜且影響因素多,目前臨床上用于治療肝纖維化且療效確切、安全性好的藥物有限[2],所以對于抗肝纖維化藥物的研發是亟需解決的問題。JAK/STAT信號通路是與炎癥信號傳遞及細胞凋亡等生理活動相關的信號通路[3,4],研究發現肝纖維化的發生及進展與JAK/STAT信號通路表達異常密切相關[5,6]。黃芪建中湯是基于傳統中醫學理論的中藥成方制劑,最早記載于中國古典醫學著作《金匱要略》。現代醫學研究發現黃芪建中湯對肝臟疾病具有治療作用,且在臨床應用中表現出顯著療效[7,8]。本文通過研究黃芪建中湯對肝纖維化大鼠的作用及機制,旨在為黃芪建中湯的藥理作用研究及肝纖維化治療藥物的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 Sprague Dawley雄性大鼠60只,8周齡,體重200～220 g,購于海南醫學院實驗動物中心[許可證號:SCXK(瓊)2018-0002],實驗動物房溫度24～26℃,濕度55%,光照12 h/d,自由飲食,單籠分組飼養,適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 藥品及試劑 黃芪建中湯(黃芪、桂枝、生姜各9 g,白芍18 g,炙甘草6 g,大棗4枚和飴糖30 g)由藥材飲片制成每毫升含18.4 g生藥的制劑,購自北京同仁堂制藥有限公司;秋水仙堿購自北京嘉林藥業股份有限公司(國藥準字:H20003842);HA(貨號:CSB-EL010918RA)、PCⅢ(貨號:CSB-E15810r)、LN(貨號:EK0435)酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自和序生物公司、ColⅣ酶(貨號:KT-32025) ELISA檢測試劑盒購自默瑞(上海)生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液(貨號:P0013B)、RNA提取試劑盒(貨號:R0016)、cDNA逆轉錄試劑盒(貨號:D7168L)、SOD活性(WST-8法)檢測試劑盒(貨號:S0103),MDA檢測試劑盒(貨號:S0131M),p-JAK2(貨號:AF1486)、p-STAT3(貨號:AF1495)、JAK2(貨號:AF1489)、STAT3(貨號:AF1492)及GAPDH兔單克隆抗體(貨號:AF1186),辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(貨號:A0208)、化學發光試劑盒(貨號:P0018M)、TNF-α (貨號:PT516)、IL-1β(貨號:PI303)、IL-6(貨號:PI328)ELISA試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;蘇木素染液(貨號:J28N6Y6648)、伊紅染液(貨號:Y13M6C2)均購自源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器及設備 CKX53倒置顯微鏡(日本Olympus公司);1～16 k高速冷凍離心機(德國sigma公司);SpectraMax iD3多功能酶標儀(美谷分子儀器有限公司);GIS-500凝膠成像儀(杭州米歐儀器有限公司);DM2500光學/熒光顯微鏡(德國LEICA公司);Leica RM2245型石蠟切片機購自徠卡貿易有限公司;DYC456-8型電泳槽(北京六一儀器廠);HBS-1096C型酶標儀(南京德鐵實驗設備公司)。

1.4 肝纖維化大鼠建模及給藥 大鼠按照15只/組隨機分為對照組、模型組、黃芪建中湯組及陽性對照組,除對照組,其余各組參照文獻[9,10]建立四氯化碳誘導(CCl4)的肝纖維化大鼠模型,具體方法為:每只大鼠按照3 ml/kg的劑量首次腹腔注射CCl4,之后按照3 ml/kg腹腔注射體積分數為50%的CCl4橄欖油溶液(橄欖油∶CCl4=1∶1),每周2次,連續給藥8周后,隨機抽取3只大鼠,以戊巴比妥溶液麻醉后斷頸處死,迅速分離肝組織,采用蘇木精-伊紅染色法(HE染色)檢查肝組織病理學變化,以評價造模是否成功,對照組大鼠腹腔注射給予等量橄欖油。未有大鼠在造模過程中死亡,45只造模大鼠中19只出現輕度腹水。黃芪建中湯組根據大鼠體重按照10 ml/kg的劑量灌胃給予大鼠黃芪建中湯(每毫升含18.4 g生藥)[11],陽性對照組按照0.2 mg/kg灌胃給于大鼠秋水仙堿[10],1次/d,給藥60 d[9]。

1.5 血清ALP、GGT、ALT、AST水平檢測 大鼠眼眶取血至離心管中,4℃靜置4 h后,4℃,3 500 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,進樣至全自動生化分析儀測定ALT、AST、ALP、GGT水平。

1.6 血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平測定 大鼠麻醉腹主動脈取血至離心管中,4℃靜置4 h后,以4℃,3 500 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,分別按照ELISA試劑盒說明書方法測定HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平。

1.7 肝組織MDA水平及SOD活性測定 取大鼠肝組織,置于組織勻漿器中研磨勻漿后,以12 000 rpm,4℃離心10 min,離心半徑13.5 cm,按照試劑盒規定操作方法測定肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6及MDA水平及SOD活性。

1.8 肝組織病理學檢查 取大鼠部分肝組織(6只/組),于中性甲醛中固定12 h后,置于石蠟包埋機中進行包埋,行5 μm切片,分別進行HE染色及Masson染色,顯微鏡下觀察。

1.9 肝組織中JAK2、STAT3 m RNA水平測定 每組取6只大鼠。按照RNA提取試劑盒方法提取大鼠肝組織總RNA,并將總RNA逆轉錄成cDNA,熒光定量PCR檢測肝組織JAK2及STAT3 m RNA的表達。用于檢測實時定量PCR的各基因引物見表1,以β-actin為內參,2-ΔΔCt法計算表達量。

表1 各檢測基因引物序列

1.10 肝組織JAK2、STAT3蛋白水平檢測 取大鼠(6只/組)肝組織,使用裂解液裂解并進行組織勻漿,以4℃,12 000 rpm離心10 min,離心半徑13.5 cm,取上清液,置于100℃水浴5 min變性。BCA法測定蛋白濃度后,取50 μg蛋白進行電泳分離,經轉膜、封閉液封閉后,JAK2、STAT3及GAPDH抗體(1∶1 000)4℃孵育過夜。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜后,加入稀釋(1∶2 000)后的山羊抗兔IgG室溫條件下孵育2 h,PBST洗滌后,置于凝膠成像儀滴加適量發光液成像,使用Image J軟件檢測分析。

2 結果

2.1 大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平 見表2。

表2 各組大鼠血清ALP、GGT、ALT、AST水平

2.2 大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平 見表3。

表3 各組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平

2.3 大鼠肝組織MDA水平及SOD活性水平 見表4。

表4 各組大鼠肝組織SOD活性及MDA水平

2.4 各組大鼠肝組織病理學檢查 對照組大鼠肝組織無病理學改變;與對照組大鼠肝組織病理檢查結果相比,模型組大鼠肝組織病理學提示細胞形狀不規則,結構破壞,可見氣泡樣改變及大量炎性細胞浸潤,肝組織纖維樣改變,肝組織細胞壞死、脫落;與模型組比較,黃芪建中湯組及陽性對照組大鼠肝組織細胞組織病理學明顯改善,肝細胞結構較完整,細胞壞死及炎性浸潤明顯減輕,纖維增生明顯減輕。各組大鼠肝組織病理學檢查結果見圖1、2。

圖1 各組大鼠肝組織病理學檢查結果 (×200)

圖2 大鼠肝組織Masson結果 (×200)

2.5 大鼠肝組織JAK2及STAT3 mRNA水平 見表5。

表5 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3 mRNA水平

2.6 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平比較 與對照組比較,模型組、黃芪建中湯組及陽性對照組肝組織JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平顯著升高(P<0.05);與模型組比較,黃芪建中湯組及陽性對照組大鼠肝組織JAK2、STAT3、p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平顯著降低(P<0.05);黃芪建中湯組p-JAK2/JAK2及p-STAT3/STAT3水平較陽性對照組顯著降低(P<0.05);陽性對照組大鼠JAK2及STAT3蛋白水平與黃芪建中湯組不存在顯著性差異(P>0.05)。各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平見圖3及表6。

圖3 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平

表6 各組大鼠肝組織JAK2及STAT3蛋白水平

3 討論

肝纖維化是指由病毒性肝炎、酒精肝、脂肪肝、自身免疫性肝病等肝臟疾病所致的肝內結締組織異常增生,如果致病因素長期不能去除,則會發展成肝硬化[1]。肝纖維化在臨床表現上無顯著特點,其進展為肝硬化等疾病過程中則常表現出疲乏無力、食欲減退、消化不良[12]。目前臨床上用于治療肝纖維化的藥物有限,且存在有效率低等缺點,所以對于治療肝纖維化藥物的研發是目前的臨床工作重點之一。

黃芪建中湯是由黃芪、桂枝、白芍、生姜等多種中藥材組成的中藥成方制劑,具有補脾益氣,溫陽散寒之功效,主要用于治療用于氣虛里寒,腹中拘急疼痛等疾病[13],廣泛記載于中國古代醫學著作中。現代研究表明,黃芪建中湯具有抗胃潰瘍、抗腫瘤、抗疲勞及抗慢阻肺等多種藥理作用[14-16]。張燕云等[7]報道了黃芪建中湯對病毒性肝炎具有一定的治療作用;唐文哲等[8]研究發現黃芪建中湯對自身免疫性肝炎具有一定的改善作用;黃恒霞[17]報道了黃芪建中湯對肝郁脾虛癥具有明顯的改善作用。

JAK/STAT信號通路是多種細胞因子信號轉導的共同途徑,與細胞增殖、分化、凋亡以及炎癥等過程密切相關[18]。研究發現,JAK/STAT通路的異常激活能夠促進炎癥性疾病、淋巴瘤、白血病以及實體腫瘤等各種疾病的發生、發展[19]。孫玉霞等[20]發現慢性萎縮性胃炎模型大鼠的發病機制與JAK/STAT的異常激活有關,陳宇斐等[21]報道了JAK2/STAT3通路的異常激活能夠誘導乳腺癌細胞的增殖和遷移。近年來有學者發現JAK/STAT通路的異常激活與肝纖維化的發病機制及疾病進展相關[22,23],其中,蔣亞玲等[22]報道了肝星狀細胞纖維化病變與其JAK/STAT相關蛋白水平升高;李晉等[23]則發現川芎嗪能夠改善小鼠肝纖維化癥狀,其機制與抑制JAK/STAT信號通路有關。

ALT、AST、ALP、GGT水平是反映肝功能的重要指標,其水平的升高提示肝細胞損傷壞死;PCⅢ是反映肝內Ⅲ型膠原合成的指標,與肝纖維化形成的活動程度密切相關;ColⅣ是肝纖維化過程中的早期標志之一,含量增高可較靈敏反映出肝纖維化過程;LN水平升高也能反映肝纖維化的進展,HA為基質成分之一,由間質細胞合成,其水平升高反映肝內已生成的纖維量及肝細胞受損狀況,是肝纖維化和肝硬變的敏感指標[24]。肝組織SOD活性及MDA水平是反映肝組織細胞氧化應激損傷的重要指標,SOD活性降低及MDA水平升高則表明大鼠肝纖維化大鼠的肝組織氧化應激損傷加重[25]。本實驗通過采用腹腔注射四氯化碳法建立大鼠肝纖維化模型,研究黃芪建中湯對其的治療作用及機制。結果表明,與模型組比較,黃芪建中湯組大鼠血清ALT、AST、ALP、GGT、HA、LN、PCⅢ、ColⅣ水平,大鼠肝組織MDA水平顯著降低,肝組織SOD活性顯著升高,提示黃芪建中湯能夠明顯改善肝纖維化大鼠的肝功能,抑制大鼠肝纖維化進展,改善大鼠肝組織細胞氧化應激損傷狀態,促進大鼠肝組織細胞的恢復。同時,結果表明,黃芪建中湯組大鼠肝組織中JAK2及STAT3mRNA水平及JAK2、STAT3蛋白水平均顯著降低,提示黃芪建中湯能夠顯著抑制JAK/STAT信號通路相關蛋白的異常表達,進而抑制JAK/STAT信號通路的過度激活,發揮其抗肝纖維化作用。黃芪建中湯組能夠明顯改善大鼠肝功能,降低肝纖維化大鼠肝纖維化水平及肝臟氧化應激損傷,其機制可能與調節JAK/STAT信號通路有關。