2型糖尿病相關(guān)非酒精性脂肪性肝病老齡小鼠模型的建立*

韓 拓 周 靜 李 盈 徐 陽 李 成 姬 婧 張春艷 李永勤 張 巖△ 王聰霞

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 (陜西 西安,71004) 2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已經(jīng)成為全球最為常見的慢性肝臟疾病之一,據(jù)統(tǒng)計,全球約25%的成年人患有NAFLD[1]。肥胖、2型糖尿病是NAFLD發(fā)生的重要危險因素[2]。有研究表明,55%～70%的2型糖尿病(T2DM)患者中合并有NAFLD,37.3%已出現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[3]。闡明T2DM與NAFLD之間的共同發(fā)病機(jī)制有賴于穩(wěn)定且高效的實(shí)驗(yàn)動物模型。然而,目前多數(shù)研究經(jīng)常使用的動物模型雖在一定程度上能夠模擬T2DM患者肝臟病理改變,但都存在不足之處[4]。此外,T2DM和NAFLD都屬于增齡性疾病,而現(xiàn)有動物實(shí)驗(yàn)很少有在老齡鼠中開展。本研究利用C57BL/6J老齡小鼠,通過高脂飲食(HFD)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM合并NAFLD的老齡小鼠模型,為今后相關(guān)研究提供更理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 高脂飼料(購自廣州睿迪生物公司,貨號#D12492,含60%的脂肪),鏈脲佐菌素(購自Sigma公司,貨號#S0130),油紅O粉末(購自Sigma公司,貨號#O0625),蘇木素-伊紅染液(購自陜西中暉赫彩有限公司),總膽固醇與三酰甘油測定試劑盒(購自中生北控生物科技公司),BCA蛋白定量試劑盒(購自碧云天生物公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全自動血液生化分析儀(貝克曼公司,型號#AU5800),電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司,型號#CP224C),臺式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司,型號#Microfuge 20R),輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國萊卡公司,型號#HistoCore MULTICULT),正置顯微鏡成像系統(tǒng)(德國萊卡公司,型號#DM2000LED)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物與造模方案 18周齡C57BL/6J雄性小鼠共16只購自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(陜) 2018-001),飼養(yǎng)于清潔級環(huán)境,室內(nèi)溫度(22±2)℃,自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為模型組與對照組(n=8只/組)。模型組小鼠全程給予高脂飼料(HFD)喂養(yǎng),對照組小鼠給予普通飼料。自第3周開始,模型組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg的鏈脲佐菌素(STZ,注射前過夜禁食14 h),對照組給予等體積檸檬酸/檸檬酸鈉溶液腹腔注射。注射結(jié)束后3 d和1 w后分別于尾尖采血測禁食4～5 h后的血糖水平,血糖超過11.0 mmol/L表明糖尿病造模成功。期間模型組先后有3只小鼠死亡,對照組無小鼠死亡。每周監(jiān)測體重,繼續(xù)飼喂至第6 w造模結(jié)束,腹腔麻醉、眼球采血,分離心臟、肝臟及腎臟,進(jìn)行血漿生化與組織病理檢測。

1.4 血漿生化檢測 小鼠摘眼球取血,EDTA抗凝后4℃、3 000 r/min離心15 min,收集上層血漿。采用全自動血液生化分析儀檢測各組小鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、尿素氮、胱抑素C,以及血漿葡萄糖、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇水平。

1.6 H&E組織病理染色 肝、心、腎組織于4%多聚甲醛固定48 h以上,流動水沖洗30 min,進(jìn)行組織脫水、包埋與石蠟切片,切片厚6 μm。常規(guī)脫蠟入水,蘇木素染液浸染3 min,流動水漂洗數(shù)秒,伊紅染液浸染3～5 min,顯微鏡下觀察。梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.7 肝臟脂質(zhì)含量檢測 取小鼠肝臟50 mg,用眼科剪在冰上快速剪碎并倒入玻璃勻漿器中,加入2 ml預(yù)冷的PBS,將勻漿器下端插入冰水中充分研磨5～8 min,制備肝組織勻漿。10 000 r/min、4℃離心10 min,取上清液備用。參照試劑盒說明書操作,使用紫外可見分光光度計檢測上清液與血漿總膽固醇和三酰甘油含量。采用BCA法測定上清液中蛋白濃度,以校正肝臟內(nèi)總膽固醇與三酰甘油含量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況與體重變化 造模前兩組小鼠一般情況良好,活動自如,體重接近(P>0.05)。模型組給予HFD喂食2周后,體重增加較對照組更明顯,盡管組間差異并無顯著性(P>0.05)。經(jīng)連續(xù)5 d過夜禁食與腹腔注射STZ或檸檬酸鈉溶液后,兩組小鼠體重均迅速減輕。對照組小鼠在后續(xù)4周中體重逐漸恢復(fù),而模型組小鼠體重則持續(xù)降低,造模結(jié)束時甚至低于對照組(P<0.05,圖1)。

圖1 小鼠體重變化(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=8只/組)

2.2 小鼠主要臟器重量比較 造模結(jié)束后,小鼠腹腔麻醉、摘眼球取血,分離肝臟、心臟及腎臟并稱重。與對照組相比,模型組小鼠肝臟重量顯著增加(P<0.05),肝臟指數(shù)增加(P<0.01),而心臟、腎臟重量則無明顯改變(P>0.05,圖2)。

圖2 小鼠主要臟器質(zhì)量比較(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=8只/組)

2.3 主要臟器組織病理染色 H&E染色結(jié)果顯示,正常對照小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞大小、形態(tài)正常;模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡與氣球樣改變,部分細(xì)胞核溶解消失,小葉結(jié)構(gòu)破壞,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤增加。同時,模型組小鼠心肌纖維排列紊亂、血管周圍單核細(xì)胞增多;腎小球周圍炎癥細(xì)胞聚集增多(圖3)。

2.4 血糖與肝腎功能檢測 如圖4所示,與對照組比較,模型組小鼠血漿葡萄糖水平明顯升高(P<0.001),谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著增加(P<0.001),腎損傷指標(biāo)胱抑素C水平增加(P<0.05),盡管尿素氮與血肌酐含量組間無明顯差異(P>0.05)。

圖4 小鼠肝腎功能指標(biāo)檢測

2.5 血脂譜水平 與對照組比較,模型組小鼠血漿總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著升高(P<0.01或P<0.001),見圖5。

圖5 血脂譜水平

2.6 肝臟油紅O染色與脂質(zhì)含量 油紅O染色結(jié)果顯示,正常對照小鼠肝臟內(nèi)脂滴非常細(xì)小,模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯、蓄積增多,肝內(nèi)總膽固醇與甘油三酯含量明顯增加(P<0.05或P<0.01,圖6)。

圖6 肝臟油紅O染色(×100)與肝內(nèi)脂質(zhì)含量

3 討論

隨著現(xiàn)代生活方式和飲食習(xí)慣的改變,NAFLD的發(fā)病率與患病人數(shù)正在不斷增加,已成為最常見的慢性肝病之一,全球約有1/4的人群患有NAFLD[1,5]。我國NAFLD患病率更是高達(dá)29.2%,其中肥胖、T2DM及胰島素抵抗與NAFLD的流行密切相關(guān)[6]。T2DM患者合并NAFLD的情況非常普遍。據(jù)統(tǒng)計,全球約有55.5%的T2DM患者合并有NAFLD,37.3%的患者進(jìn)展為NASH,17.0%的患者出現(xiàn)晚期肝纖維化[3]。T2DM患者出現(xiàn)嚴(yán)重肝臟相關(guān)疾病或死亡的風(fēng)險較非糖尿病患者升高2.25倍(95%CI:1.83～2.76)[7]?，F(xiàn)常采用的糖尿病或NAFLD動物模型,為闡明T2DM及相關(guān)脂肪肝病發(fā)病機(jī)制與藥物研發(fā)做出了巨大貢獻(xiàn)[8,9]。然而,不同的疾病模型其發(fā)病機(jī)制與病理表現(xiàn)存在較大差異,并不能完全模擬和反映T2DM患者中NAFLD的疾病進(jìn)展與病理機(jī)制[4,10]。

目前,糖尿病常見造模方法包括基因缺陷動物、高脂飲食和化學(xué)藥物誘導(dǎo)等[11]。前者常見有ob/ob小鼠、db/db小鼠、Zucker大鼠、SHR/N-cp大鼠及JCR:LA-cp大鼠等[10]。這些嚙齒類動物模型均是由于瘦素或瘦素受體缺陷而導(dǎo)致攝食過多,最終發(fā)展為肥胖,出現(xiàn)類似T2DM樣表現(xiàn)[10]。這實(shí)際上與人類T2DM發(fā)病機(jī)制存在很大差異,因?yàn)樵诜逝趾蚑2DM患者中通常并不缺乏瘦素,甚至存在“瘦素抵抗”現(xiàn)象[12,13]。此外,基因缺陷小鼠價格昂貴、實(shí)驗(yàn)成本較高,這也極大限制了其在科學(xué)研究中的應(yīng)用。高脂飲食能夠誘導(dǎo)胰島素抵抗與外周高胰島素血癥,以及糖尿病心肌病等發(fā)生,已被廣泛用于糖尿病動物造模[9,14]。然而,高脂飲食造模周期較長,通常達(dá)3～4個月以上,且目前研究報道中所使用的高脂飼料配比,尤其是脂肪和糖水化合物含量,以及造模周期、小鼠品系及周齡等差異較大,缺乏規(guī)范性與可比性[4,15]。相比之下,化學(xué)藥物誘導(dǎo),如STZ、四氧嘧啶及糖皮質(zhì)激素等,因其經(jīng)濟(jì)性、操作方便和快速出模而被廣泛使用[11]。其中STZ與四氧嘧啶主要通過短期大量破壞胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素分泌絕對不足,是1型糖尿病造模的經(jīng)典模型。也有國內(nèi)學(xué)者采用地塞米松腹腔注射聯(lián)合高脂乳劑灌胃5 d快速誘導(dǎo)BALB/c小鼠發(fā)生肝脂肪變性[16]。然而,這種方式實(shí)際類似于臨床上庫欣綜合征或長期使用激素引起的脂肪肝患者,與大多數(shù)NAFLD患者發(fā)病機(jī)制存在較大差異。此外,T2DM與NAFLD均屬于增齡性疾病,老年人群中的發(fā)病率顯著增加[6,17]。然而,現(xiàn)有糖尿病或脂肪肝動物實(shí)驗(yàn)很少在老齡鼠中開展。

本研究利用老齡C57BL/6J小鼠,通過高脂飲食喂養(yǎng)6周聯(lián)合低劑量STZ連續(xù)腹腔注射5 d,成功建立了T2DM相關(guān)脂肪肝老齡小鼠模型。模型組小鼠肝臟重量與肝臟指數(shù)明顯增加,肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡與氣球樣改變,小葉結(jié)構(gòu)破壞,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤增加;心肌組織與腎皮質(zhì)亦出現(xiàn)相應(yīng)病理改變。同時,血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及胱抑素C水平顯著升高,提示肝腎功能損傷發(fā)生,符合T2DM合并NAFLD的病理特征。此外,模型組小鼠血漿中葡萄糖、血脂系列均顯著升高,肝臟油紅O染色顯示脂滴大量蓄積,肝內(nèi)總膽固醇與三酰甘油含量增加,均證實(shí)NAFLD與肝脂肪變性發(fā)生。

綜上所述,本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合STZ造模,快速有效地建立起T2DM合并NAFLD的老齡小鼠模型,從而較好地模擬臨床T2DM患者發(fā)生脂肪肝的病理過程。該造模方法穩(wěn)定可靠、可行性強(qiáng),且操作簡單、周期較短,為今后相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究與治療藥物研發(fā)提供了理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。