微小RNA-127-3p在乙型肝炎病毒相關性肝癌中的表達意義及對HBV陽性肝癌細胞增殖遷移侵襲的影響*

劉洪濤 馮守寧 劉金強 吳慧麗

1.鄭州人民醫院急診科 (河南 鄭州,450000) 2.鄭州中心醫院消化內科

肝細胞癌是臨床上最常見惡性腫瘤之一,發病率和死亡率分別位列第7位和第4位。肝癌早期癥狀不明顯,多數患者一經發現已處于中晚期,預后不佳,5年生存率僅為15%～40%,給患者的生命安全帶來嚴重威脅[1]。乙型肝炎病毒(HBV)是肝細胞癌最常見的危險因素,HBV相關性肝癌在國內的原發性肝癌病例中占80%左右,HBsAg呈陽性患者患肝細胞癌地風險比HBsAg陰性人群高10～50倍[2]。因此,早期診斷、早期治療可極大提高患者的治愈率,延長生存期。微小RNA(miRNA)是一種小的類似于小干擾RNA(siRNA)的分子,參與多種腫瘤細胞的分化、增殖、凋亡等多個過程,現已成為新一代疾病診斷與分子靶向治療的標志物[3,4]。miR-127-3p是一種小分子的非編碼RNA,在不同癌癥中均具有重要作用,研究表明,其在胃癌、宮頸癌患者中表達水平較低,并對癌細胞的生長、增殖主要起抑制作用[5,6]。目前關于miR-127-3p在HBV相關性肝癌中的表達意義及其對肝癌細胞生物學行為的影響研究鮮有報道。基于此,本研究探討miR-127-3p在HBV相關性肝癌中的表達意義及對HBV陽性肝癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響,為HBV陽性肝癌分子靶向治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 肝癌組織標本來源 肝癌組織標本均取自2018年12月至2020年12月在醫院普通外科接受手術切除的64例HBV相關性肝癌患者。所有標本采集均經過患者及其家屬同意并簽署知情同意書。所有患者乙型肝炎表面抗原HBsAg或HBV DNA檢查為陽性,且術前均未行放化療,術后病理證實為HBV相關性肝癌。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 實時熒光定量聚合酶鏈反應 通過實時熒光定量聚合酶鏈反應(RTFQ-PCR)檢測肝癌及癌旁組織miR-127-3p相對表達量。Trizol法提取肝癌組織、癌旁組織及細胞中總RNA。以5 μl總RNA為模板,使用RT-PCR試劑盒(上海吉瑪制藥技術有限公司)將RNA反轉錄成cDNA,總反應體系:2 μl cDNA,2.5 μl Taq DNA聚合酶,0.5 μl上下游引物,10 μl雙蒸水。以逆轉錄產物為模板,在美國ABI 7300實時熒光定量PCR儀系統上進行擴增,反應條件:95℃預變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火45 s,共35個循環。每個樣品的CT值以U6作為內參進行校正,△CT=CT目的基因-CTU6,采用2-ΔΔCt法計算miRNA的相對表達量。miRNA的引物序列來自Sanger數據庫,由上海賽百勝基因技術有限公司合成。miR-127-3p正向引物序列:5′-UGAUUGGUACGUCUGUGGGUAGTT-3′,反向引物序列:5′-CUACCCACAGACGUACCAAUCATT-3′;內參基因U6上游序列:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游序列:5'-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.3 肝癌HepG2細胞培養與轉染 將購于上海生工生物工程股份有限公司的人肝癌HepG2細胞株快速解凍,加入RPMI-1640培養液(含10%小牛血清及1%的青霉素鏈霉素雙抗),混勻后置于離心機中,1 000 rpm/min離心5 min,棄上清,用8 ml配好的RPMI-1640重懸細胞并吹打混勻,將細胞懸液移至培養瓶中,于37℃、5% CO2、濕度 85%的細胞培養箱中培養。倒置顯微鏡下觀察細胞,待瓶底鋪滿時棄上清,用高溫滅菌的1×PBS洗滌3次,加入2 ml胰蛋白酶,常溫靜置4 min,棄去胰蛋白酶,用含10%FBS的1640培養液終止消化,反復吹打后將細胞懸液置于15 ml離心管,1 000 rpm/min離心5 min,獲得細胞沉淀。轉染前24 h,將肝癌HepG2細胞接種于6孔板中,待細胞長到80%匯合度時,按照LipofectamineTM2000試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)操作說明書將不同濃度的miR-127-3p mimic(10、20、50 pmol)(廣州市銳博生物科技有限公司)和LipofectamineTM2000混合均勻,用完全培養基定容至2 ml,8 h后更換新鮮培養基,48 h后收集細胞提取總RNA檢測轉染效率及進行功能實驗。對照組(0 pmol miR-127-3p mimic)加等量Opti-MEM培養基進行培養。

1.4 HepG2細胞中miR-127-3p表達量檢測 取各組轉染48 h后細胞,以RTFQ-PCR檢測miR-127-3p表達量,具體操作方法同癌癥組織與癌旁組織miR-127-3p相對表達量檢測步驟。

1.5 MTT法檢測各轉染組細胞增殖情況 收集10、20、50 pmol miR-127-3p mimic轉染組及對照組細胞,0.25%胰酶消化后重懸,按照2.0×104個/ml接種至96孔板,每組5個復孔,培養至48 h時,加入新鮮制備的20 μl MTT溶液(5 mg/ml)(武漢普諾賽生命科技有限公司),同條件培養4 h后棄去上層培養液,各孔加入150 μl DMSO溶液,振蕩至紫色結晶充分溶解,使用酶標儀于波長570 nm處測定各孔的光密度(optical density,OD)值。重復實驗3次。細胞增殖率=(OD試驗-OD空白)/(OD對照-OD空白)×100%。

1.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力 用馬可筆在6孔板背后劃均勻平行的橫線,間隔約1 cm,橫穿過孔,每孔至少穿過5條線,在孔中加入5×105個細胞的培養基,次日待細胞鋪滿孔底后,使用槍頭垂直于馬可筆的橫線劃痕,PBS漂洗細胞3次,去除劃下的細胞,加入無血清培養基,于37℃、5% CO2的細胞培養箱中培養,于48 h取出,于倒置顯微鏡下觀測拍照,測量周邊細胞向劃痕區域中央遷移的距離。

1.7 Transwell實驗檢測細胞侵襲能力 提前將Matrigel基質膠均勻平鋪于上室,消化收集各轉染組細胞,用無血清培養基重懸,將含7×104個細胞的無血清細胞懸液200 μl添加至小室上層,小室下層添加含10% FBS的血清DMEM培養基作為誘導物,常規培養48 h后終止培養,用體積分數4%多聚甲醛固定細胞15 min,擦去小室內室膜上的細胞,1%結晶紫染色30 min,輕輕擦去小室上層未穿膜細胞,用自來水清洗后于室溫晾干,用Olympus顯微鏡(200×)隨機選取3個視野計算穿膜細胞并進行統計。

2 結果

2.1 肝癌組織與癌旁組織miR-127-3p表達量比較 見表1。

表1 肝癌組織與癌旁組織miR-127-3p表達量比較

2.2 各轉染組細胞miR-127-3p表達量比較 見表2。

表2 各轉染組細胞miR-127-3p表達量比較

2.3 各轉染組細胞增殖情況比較 見表3。

表3 各轉染組細胞增殖情況比較

2.4 各轉染組細胞遷移能力比較 見表4。各轉染組細胞遷移形態見圖1。

圖1 各轉染組miR-127-3p對肝癌HepG2細胞遷移的影響

表4 各轉染組細胞遷移能力比較

2.5 各轉染組細胞侵襲能力比較 見表5。各轉染組細胞結晶紫染色見圖2。

圖2 各轉染組miR-127-3p對肝癌HepG2細胞侵襲的影響(結晶紫染色×200)

表5 各轉染組細胞侵襲能力比較

3 討論

HBV感染作為肝細胞癌的主要病因已被世界公認,每年0.4%～0.6%的HBV慢性感染者被診斷為肝癌,其危險程度遠高于非感染者[7]。miRNA是一類長19～25 nt的非編碼微小RNA,作為基因表達的轉錄后調控因子,是基因調控網絡中的核心成分,廣泛存在于從病毒到人類的各種生物中,近年來逐漸被報道廣泛參與包括細胞生長、增殖、分化凋亡等多種生物進程,包括腫瘤的形成,且不同miRNA在不同的腫瘤中發揮不同作用,包括致癌和抑癌作用[8]。miRNA與HBV相關性肝癌的發生發展具有密切關系,但其表達存在顯著差異,作用機制也多有不同。因此明確HBV感染引起肝細胞肝癌的發生機制、尋找新的早期診斷指標以及治療靶標具有重要作用。

miR-127-3p是人類miR-127基因前體可以表達的成熟miRNA之一,在多種腫瘤組織中均有表達,但表達程度不同[9]。典輝等[10]報道顯示,miR-127-3p在乳腺癌組織中的表達高于癌旁組織,認為其在乳腺癌中發揮促癌作用。但多數研究均顯示[11,12],miR-127-3p是一種腫瘤抑制因子,可通過不同信號通路抑制葡萄膜黑色素瘤、人骨肉瘤等腫瘤細胞的增殖。如Ji等[13]研究報道顯示口腔鱗狀細胞癌患者miR-127-3p表達下調,認為miR-127-3p通過影響KIF3B信號通路抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲。另有研究報道稱[14],miR-127-3p通過下調MAPK4抑制大鼠卵巢癌的增殖。上述文獻報道證實miR-127-3p在腫瘤中主要發揮抑癌作用。本研究結果表明,HBV相關性肝癌患者肝癌組織miR-127-3p表達量低于癌旁組織,提示miR-127-3p在HBV相關性肝癌患者中低表達,可作為重點篩查指標,以提前預警并監測肝癌的發生。

據報道,肝癌發生的潛在機制是肝細胞中載脂蛋白B mRNA編輯酶催化亞基2的過表達誘導的抑癌基因突變[15]。miRNA可通過靶向HBV基因表達所需的細胞轉錄因子或通過直接結合HBV轉錄物來調節HBV轉錄水平的感染[16]。Li等[17]研究顯示,miR-122可以特異性結合酶催化亞基2 mRNA的3′-非翻譯區(3′UTR),從而抑制肝癌細胞的表達。本研究結果顯示,上調miR-127-3p表達后,肝癌HepG2細胞增殖率降低,遷移距離減小,穿膜細胞數減少,說明miR-127-3p參與了HBV陽性肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲,并呈負調控作用,與張玉蓉等[18]研究結果基本一致,證實miR-127-3p在HBV陽性肝癌中發揮抑癌作用。推測其作用機制可能與miR-127-3p可靶向下調MAPK4表達,抑制其下游蛋白MAPKAPK5及HSPB1磷酸化有關[19]。

綜上所述,miR-127-3p與HBV相關性肝癌的發生、發展關系密切,在肝癌患者中呈低表達,可作為重點關注指標。此外,miR-127-3p過表達可抑制肝癌HepG2細胞的增殖、遷移和侵襲能力,發揮抑癌作用,但具體作用機制仍需更深入挖掘探究,以期發現肝癌早期診斷及靶向治療的新途徑。