張家界和湘西地區(qū)鲊廣椒細菌菌群多樣性比較分析

陳邵德罡，柯 悅，郭 壯，趙慧君，王玉榮*

（1.湖北文理學院 湖北省食品配料工程技術研究中心，湖北 襄陽 441053；2.湖北文理學院 乳酸菌生物技術與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽 441053）

鲊廣椒又稱酢辣椒、包谷酸辣子或鲊辣椒等，其主要以玉米面或大米粉和辣椒為原料，加輔料剁碎拌勻經密封發(fā)酵15～30 d而成，具有酸、辣和鮮的特點[1]。王玉榮等[2]通過研究發(fā)現(xiàn)湖北省當陽地區(qū)鲊廣椒中主要細菌類群以乳酸桿菌（Lactobacillus）為主，其所在團隊亦對湖北省秭歸[3]、荊州[4]和洪湖[5]地區(qū)以及貴州省遵義地區(qū)[6]鲊廣椒細菌菌群多樣性進行了解析，亦發(fā)現(xiàn)Lactobacillus為其優(yōu)勢細菌屬。尹小慶等[7]對鲊廣椒中微生物和風味之間的關聯(lián)性進行了揭示，結果發(fā)現(xiàn)Lactobacillus與47種揮發(fā)性化合物顯著相關（P＜0.05），且鲊廣椒特征風味的形成與乳酸菌類群構成息息相關[8]。由此可見，鲊廣椒中蘊含了豐富的乳酸菌資源且其對產品風味品質的形成具有積極作用。

CAI W等[9]對湘西地區(qū)鲊廣椒和糯米酸細菌菌群多樣性進行了解析，結果發(fā)現(xiàn)雖然兩類淀粉質發(fā)酵食品均富含乳酸菌，但由于其所使用的原料分別為大米和糯米，因而兩者細菌類群存在顯著的差異。CAI W等[10]亦發(fā)現(xiàn)，重慶和湖北地區(qū)的鲊廣椒細菌類群均以乳酸菌為主，但不同地區(qū)的鲊廣椒其乳酸菌類群構成存在一定差異。湖南省位于長江中游，大部分區(qū)域在洞庭湖以南，其中湖南西北部主要包括張家界市和湘西土家苗族自治州，多山地峰林，生態(tài)環(huán)境較好[11]。湘西土家苗族自治州地處低緯度帶，而張家界地處北中緯度，且兩地相差100多km，氣候和環(huán)境均存在一定差異。由此可見，對采集自張家界和湘西地區(qū)的鲊廣椒細菌菌群多樣性進行比較分析，其研究數(shù)據(jù)不僅可以進一步加深研究人員對鲊廣椒這一特色發(fā)酵食品的了解，亦可以論證地域因素是否會對鲊廣椒的細菌群落結構產生影響。

本研究從湖南省張家界市采集了18份鲊廣椒樣品進行了MiSeq測序，同時從MGRAST數(shù)據(jù)庫下載了湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒樣品的細菌MiSeq測序數(shù)據(jù)，并在此基礎上對2份數(shù)據(jù)進行了合并分析，對2個地區(qū)鲊廣椒中關鍵細菌類群進行了揭示，探討了地域因素對鲊廣椒細菌類群的影響，通過本研究的開展以期為鲊廣椒細菌多樣性和功能的研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

DNeasy mericon Food Kit脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）基因組提取試劑盒：德國QIAGEN公司；引物338F/806R：上海桑尼生物科技有限公司；10×聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）緩沖液、脫氧核糖核苷三磷酸、DNA聚合酶：北京全式金生物技術有限公司；Axygen清潔試劑盒：康寧生命科學吳江有限公司；高通量測序配套試劑：美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

Veriti FAST梯度PCR儀：美國ABI公司；ND-2000C微量紫外分光光度計：美國Nano Drop公司；DYY-12電泳儀：北京六一儀器廠；Fluor Chem FC3化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)：美國Protein Simple公司；PE300高通量測序平臺：美國Illumina公司；R920機架式服務器：美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品采集

于2019年10月下旬從湖南省張家界市（E109°40′～111°20′，N28°52′～29°48′）采集鲊廣椒樣品18份，樣品均滿足以下標準：1）發(fā)酵時間均為30 d左右；2）無異味及發(fā)霉現(xiàn)象；3）色澤微紅；4）所有原材料均在本地種植或生產。將樣品按照ZZJ1～ZZJ18進行編號后，分別裝入采樣袋中密封保存并在常溫下帶回實驗室進行后續(xù)研究。

1.3.2 宏基因組DNA提取、PCR擴增和高通量測序

每份樣品各取2 g，使用試劑盒進行DNA提取，使用加入核苷酸標簽（Barcord）的引物338F/806R對細菌16S rRNA V3-V4區(qū)進行PCR擴增，擴增體系和程序參照向凡舒等[12]的方法。將擴增合格的產物置于干冰中寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技公司進行測序。

1.3.3 生物信息學分析

參照WANG Y等[13]的方法對張家界地區(qū)鲊廣椒細菌類群下機序列進行質控，質控合格的序列合并為一個fna文件。從MGRAST數(shù)據(jù)庫（https：//www.mg-rast.org/）下載CAI W等[9]上傳的湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒MiSeq測序數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)編號為mgp103301，并將其與張家界地區(qū)鲊廣椒測序數(shù)據(jù)進行合并，合并后的fna文件上傳至QIIME（V1.9.1）平臺進行生物信息學分析[14]，具體參照HOU Q等[15]的分析流程。首先按照97%相似性對序列集進行劃分獲得操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）矩陣，繼而從每個OTU中選取一條代表性序列使用RDP（ribosomal database project 11.5）和Greengenes 13.5數(shù)據(jù)庫對序列進行比對，明確其分類學地位，最后構建系統(tǒng)發(fā)育樹，并在此基礎上進行α多樣性和β多樣性分析。

1.3.4 鲊廣椒樣品細菌類群代謝通路的預測

基于Greengenes數(shù)據(jù)庫注釋后的代表性序列，使用PICRUSt（phylogeneticinvestigationofcommunitiesbyreconstruction of unobserved states）軟件[16]和蛋白質直系同源簇（clusters of orthologous groups of proteins，COG）數(shù)據(jù)庫[17]對2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群有差異的主要代謝途徑進行預測。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

使用Past3軟件進行數(shù)據(jù)處理，使用Mann-Whitney檢驗對2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群的α多樣性指標、優(yōu)勢種屬以及基因預測指標進行差異性分析。使用R軟件、Origin2017、GraphPad9.0軟件、STAMP軟件、AI軟件和Excel2016進行繪圖及修改。使用Huttenhower實驗室Galaxy Server進行線性判別分析效應大?。╨inear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析。

2 結果與分析

2.1 兩個地區(qū)鲊廣椒細菌類群α和β多樣性分析

納入本研究的18份張家界鲊廣椒樣品通過MiSeq測序共獲得703 576條原始序列，經質控后得到702 540條有效序列，平均每個樣品包含39 030條序列。通過將其與從數(shù)據(jù)庫中下載的湖南省湘西土族苗族自治州12份鲊廣椒樣品數(shù)據(jù)進行合并分析，本研究計算了2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群的α多樣性指標，結果見圖1。

圖1 兩個地區(qū)鲊廣椒樣品細菌類群α多樣性指標的比較分析Fig.1 Comparative analysis of α-diversity indexes among zha-chili samples collected from 2 regions

由圖1可知，經Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、超1指數(shù)、香農指數(shù)和辛普森指數(shù)差異均不顯著（P＞0.05），由此可見，2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群的豐度和多樣性差異均無明顯差異（P＞0.05）。本研究進一步基于加權和非加權UniFrac距離對2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群的群落結構進行解析，結果見圖2。

圖2 基于加權（A）和非加權距離（B）的2個地區(qū)鲊廣椒樣品細菌類群主成分分析Fig.2 Principal component analysis of bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions based on weighted (A) and unweighted (B) UniFrac distance

由圖2可知，無論是基于加權還是非加權UniFrac距離，在主成分分析得分圖中2個地區(qū)的鲊廣椒樣品均呈現(xiàn)出明顯的分離趨勢，這說明兩者細菌類群群落結構存在明顯差異。經多元方差分析（multivariate analysis of variance，MANOVA）發(fā)現(xiàn)，兩者差異顯著（P＜0.05）。由此可見，雖然2個地區(qū)鲊廣椒細菌的豐度和多樣性無明顯差異，但其細菌類群群落結構存在明顯的差異。

2.2 兩個地區(qū)鲊廣椒細菌類群比較分析

經序列比對發(fā)現(xiàn)，張家界和湘西2個地區(qū)共30份鲊廣椒樣品中的細菌類群劃分為24個門和397個屬。基于門和屬水平，2個地區(qū)平均相對含量大于1.0%的細菌類群比較分析見圖3。

圖3 基于門（A）和屬（B）水平2個地區(qū)鲊廣椒樣品細菌類群比較分析Fig.3 Comparative analysis of bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions at the phylum (A) and genus level(B)

由圖3A可知，張家界地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌門主要為硬壁菌門（Firmicutes）和變形菌門（Proteobacteria），平均相對含量分別為95.59%和3.94%，而湘西地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌門主要為硬壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria），平均相對含量分別為66.08%、27.12%和6.45%。經Mann-Whitney檢驗發(fā)現(xiàn)，3個細菌門在2個地區(qū)鲊廣椒中差異均非常顯著（P＜0.01）。由圖3B可知，張家界地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌屬主要為乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌屬（Pseudomonas），平均相對含量分別為93.04%和1.78%，而湘西地區(qū)鲊廣椒中平均相對含量大于1.0%的細菌屬為乳酸桿菌（Lactobacillus）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、腸桿菌屬（Enterobacter）和科薩克氏菌屬（Kosakonia），平均相對含量分別為57.89%、19.26%、6.09%、2.82%、2.45%、2.08%和1.10%。張家界地區(qū)鲊廣椒中Lactobacillus和Pseudomonas相對含量顯著偏高（P＜0.05），而Acetobacter、Corynebacterium、Staphylococcus、Weissella、Enterobacter和Kosakonia等含量顯著偏低（P＜0.05）。

研究表明，乳酸桿菌是產自中國[18]、土耳其[19]和韓國[20]地區(qū)泡菜的優(yōu)勢細菌類群，鲊廣椒發(fā)酵原料中亦含有辣椒等蔬菜制品，且發(fā)酵方式亦為厭氧發(fā)酵。由此可見，由于發(fā)酵原料和發(fā)酵方式的相似性使得鲊廣椒和泡菜均蘊含著豐富的乳酸菌資源。雖然張家界和湘西地區(qū)相距僅100多公里，但本研究發(fā)現(xiàn)2個地區(qū)鲊廣椒細菌菌群多樣性存在顯著的差異，這可能與其生產工藝、使用原料和生態(tài)環(huán)境不同有關[21]。本研究團隊從鲊廣椒中發(fā)現(xiàn)并命名了“恩施乳桿菌（L.enshiensis）”[22]、“鲊廣椒乳桿菌（L.zhachilii）”[23]、“安琪乳桿菌（Secundilactobacillus angeliisp.nov.）”[24]、“土家乳桿菌（Levilactobacillus tujiaesp.nov.）”[24]和“宜都促生乳桿菌（L.yiduensissp.nov.）”[25]共5個乳酸桿菌新物種，這表明鲊廣椒中乳酸菌類群的構成具有一定的獨特性，本研究亦揭示了不同地區(qū)鲊廣椒的細菌多樣性存在差異，因而在后續(xù)研究中對華中乃至西南地區(qū)鲊廣椒中蘊含的乳酸菌資源進行挖掘保護是極為必要的。

2.3 兩個地區(qū)鲊廣椒共有細菌類群分析

本研究進一步對在2個地區(qū)30份鲊廣椒樣品中均存在的OTU進行了統(tǒng)計，結果見圖4。

圖4 兩個地區(qū)鲊廣椒樣品共有細菌類群分析Fig.4 Core bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions

由圖4可知，在張家界和湘西地區(qū)鲊廣椒中均存在的OTU有3個，分別為OTU11050、OTU21819和OTU7199，相對含量分別為5.38%、12.47%和7.04%，三者累計相對含量為24.89%。本研究在每個OTU中選取一條代表性序列在數(shù)據(jù)庫中進行比對，結果發(fā)現(xiàn)其均隸屬于乳酸桿菌（Lactobacillus）。由此可見，雖然2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群存在顯著的差異，但亦共有部分乳酸桿菌類群，因而乳酸桿菌對鲊廣椒品質的形成可能具有積極的作用。

2.4 兩個地區(qū)鲊廣椒關鍵細菌類群的甄別

基于LEfSe分析兩個地區(qū)鲊廣椒關鍵細菌類群的水平條形圖見圖5。由圖5可知，LEfSe的線性判別得分為3.0時，可篩選出22個豐度差異明顯的類群，其中9個類群在張家界地區(qū)鲊廣椒中明顯偏高，在屬水平上主要為乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌（Pseudomonas），13個類群在湘西地區(qū)鲊廣椒中明顯偏高，在屬水平上主要為異桿菌屬（Allobaculum）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、產丙酸單孢菌屬（Propionicimonas）、藤黃單孢菌屬（Luteimonas）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）。值得一提的是，異桿菌屬（Allobaculum）、寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）、產丙酸單孢菌屬（Propionicimonas）和藤黃單孢菌屬（Luteimonas）在2個地區(qū)30份鲊廣椒中的含量均偏低，平均相對含量分別為0.000 3%、0.005 2%、0.000 6%和0.001 4%。由此可見，Lactobacillus和Pseudomonas可作為張家界地區(qū)鲊廣椒中的生物標志物，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）可作為湘西地區(qū)鲊廣椒中的生物標志物。

圖5 基于LEfSe分析兩個地區(qū)鲊廣椒樣品關鍵細菌類群的水平條形圖Fig.5 Horizontal bar chart of key bacterial groups in zha-chili samples collected from 2 regions based on LEfSe analysis

2.5 兩個地區(qū)鲊廣椒細菌類群差異性代謝通路的預測

本研究使用PICRUSt分析了2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群的代謝途徑，共注釋到4 793個同源蛋白簇，獲得了8個存在顯著差異的代謝途徑，結果見圖6。

圖6 兩個地區(qū)鲊廣椒樣品細菌類群差異性代謝通路的預測Fig.6 Prediction of differential metabolic pathways in zha-chili samples collected from 2 regions

由圖6可知，代謝途徑R（一般功能預測）、S（功能未知）、E（氨基酸轉運與代謝）和K（轉錄）在張家界地區(qū)鲊廣椒細菌類群中顯著高表達（P＜0.05），而代謝途徑U（細胞內運輸、分泌和囊泡運輸）、C（能量生產和轉換）、O（翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴隨蛋白）和L（復制、重組和修復）顯著低表達（P＜0.05），這說明張家界地區(qū)鲊廣椒中細菌類群對原料中的蛋白質潛在利用率更高。

3 結論

張家界地區(qū)鲊廣椒細菌類群以乳酸桿菌（Lactobacillus）和假單胞菌（Pseudomonas）為主。較之湘西地區(qū)鲊廣椒，雖2個地區(qū)鲊廣椒細菌的豐度和多樣性無明顯差異，但其細菌類群群落結構存在明顯的差異。Lactobacillus和Pseudomonas可作為張家界地區(qū)鲊廣椒中的生物標志物，而醋酸桿菌屬（Acetobacter）可作為湘西地區(qū)鲊廣椒中的生物標志物。此外，代謝途徑R（一般功能預測）、S（功能未知）、E（氨基酸轉運與代謝）和K（轉錄）在張家界地區(qū)鲊廣椒細菌類群中顯著高表達。由此可見，2個地區(qū)鲊廣椒細菌類群和功能存在明顯差異。