黑豆種皮花青素的提取工藝優化及抗氧化活性研究

溫文君，李 森，李鑫鵬，李占蓉

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西 晉中 030801）

花青素是一類多羥基酚類物質，在黑豆種皮中總花青素含量較高[1-2]?？寡趸芰κ呛诙狗N皮花青素許多重要生理功能的基礎[3]，研究表明，花青素在較低劑量時可以直接清除活性氧，具有較好的抗氧化作用[4-5]，基于此，可將其作為安全無毒的抗氧化劑應用于多種行業中[6]。由于黑豆的可直接食用性和抗氧化性，將其制成保健品成為研究開發的熱點方向。目前市場上已開發出一些生血養血和護眼明目的黑豆保健食品[7]。此外，黑豆種皮的花青素還可以作為天然著色劑和防腐劑應用于各種食品中[8]，既能保障食用安全性，又具有較高的營養價值。

目前對植物中花青素的提取方法已有大量的研究，常用的花青素提取法一般有溶劑提取法、超聲波提取法、酶提取法和微波輔助提取法等[9]。其中溶劑提取法具有操作安全的特點，但同時也具有提取時間長、溶劑消耗量大、成本高等缺點[10-11]；超聲波提取法具有浸提溫度低、時間短、速度快和節約溶劑且無污染的優點，但提取過程會產生噪音[12-13]；酶提取法反應條件溫和、無有機溶劑殘留且提取率較高，但是能耗成本及對試驗精準度的要求均較高[14-15]；微波輔助提取操作簡單、選擇性多、提取時間短、效率高[16-18]。綜合來看，微波輔助提取法可縮短提取時間，減少熱損失，且適用范圍較廣，試驗更加便利?；ㄇ嗨卦谳^高溫度下會發生分解，影響其抗氧化活性，降低其應用價值[19-21]。因此，在優化花青素提取條件時還需要考慮對抗氧化活性的影響。

黑豆種皮中花青素含量豐富，為了進一步開發黑豆中花青素資源，本研究采用微波輔助提取法，在單因素試驗的基礎上，通過正交試驗對花青素提取工藝進行優化，并通過測定其不同提取條件下的抗氧化性，進一步優化提取溫度，為黑豆種皮的合理開發及黑豆種皮花青素的深入研究和應用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

黑豆種皮（已脫殼），購于本地超市；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、水楊酸、過硫酸鉀，上海麥克林生化科技有限公司；無水乙醇、抗壞血酸，天津市致遠化學試劑有限公司；H2O2，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；FeSO4、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），上海晶純生化科技股份有限公司；2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS），羅氏集團。

1.1.2 儀器與設備

DHG-9023A 型臺式干燥箱，浙江和呈科學儀器公司；ESW-1.0 實驗室粉碎磨，上海易勒機電有限公司；ZX-S24電熱恒溫水浴鍋，蘇州力意達儀器科技有限公司；Heraeus Multifuge X1R 離心機，賽默飛世爾科技（中國）有限公司；UV-1100 紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取工藝

將黑豆種皮粉碎，過40目篩，稱取1.0 g黑豆種皮粉置于離心管中，加入體積分數為60%的乙醇溶液20 mL，350 W 微波處理30 s 后，40 ℃恒溫水浴提取30 min。

1.2.2 標準曲線的繪制

稱取10 mg 矢車菊素-3-O-葡萄糖苷，配制成0.1 mg/L 的標準溶液。分別取標準溶液0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL，并用60%乙醇定容至10 mL的容量瓶中，然后進行30 ℃恒溫水浴10 min。使用紫外可見分光光度計在520 nm處測定待測溶液的吸光度。以花青素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，得到標準曲線:y=3.458 8x-0.035 5，R2=0.992 1。

1.2.3 花青素提取量的計算

稱取1.0 g黑豆種皮粉末，以60%乙醇為提取劑，在不同試驗條件下進行花青素提取，以4 000 r/min離心10 min，取上清液在520 nm 處測定吸光度，根據“1.2.2”中的標準曲線計算提取液中花青素質量濃度（C），花青素含量（mg/g）以矢車菊素-3-O-葡萄糖苷含量計，計算公式如下：

其中：C 為花青素濃度（mg/mL）；V 為提取體系體積（mL）；n為稀釋倍數；m為黑豆種皮原料質量（g）。

1.2.4 微波輔助提取單因素試驗

1.2.4.1 乙醇體積分數的篩選

固定黑豆粉質量和乙醇體積比（料液比）為1∶20（g/mL），350 W微波30 s，40 ℃恒溫水浴提取30 min，設置乙醇體積分數分別為40%、50%、60%、70%、80%，以花青素提取量為指標篩選提取溶劑體積分數。

1.2.4.2 料液比的篩選

固定乙醇體積分數60%，350 W微波30 s，40 ℃恒溫水浴提取30 min，設置料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g/mL），以花青素提取量為指標篩選提取料液比。

1.2.4.3 提取時間的篩選

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分數60%，350 W 微波30 s，40 ℃恒溫水浴，設置水浴時間分別為20、30、40、50、60 min，以花青素提取量為指標篩選提取時間。

1.2.4.4 微波時間的篩選

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分數60%，350 W 微波不同時間（10、20、30、40、50 s），40 ℃恒溫水浴30 min，以花青素提取量為指標篩選微波時間。

1.2.4.5 提取溫度的篩選

固定料液比1∶20（g/mL），乙醇體積分數60%，350 W微波30 s，設置提取溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃，恒溫水浴30 min，以花青素提取量為指標篩選提取溫度。

1.2.5 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，選取提取溫度（A）、提取時間（B）、微波時間（C）、乙醇體積分數（D）、料液比（E）為影響因素，以黑豆種皮花青素提取量為考察指標，進行L16(45)正交試驗，因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.6 花青素抗氧化活性的測定

1.2.6.1 羥基自由基清除能力

參考高潔等[22]的方法。配制一系列質量濃度梯度的黑豆種皮花青素溶液（0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL），取不同質量濃度待測液2 mL，按順序加入2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L 乙醇-水楊酸溶液，最后加入2 mL 8.8 mmol/L H2O2后搖勻，在37 ℃恒溫水浴15 min 后取出，使用紫外可見分光光度計測定待測溶液在510 nm處的吸光度（A1），設置對照（A2）和空白（A0），以VC為陽性對照。清除率計算公式為：

1.2.6.2 DPPH自由基清除能力

參考高潔等[22]的方法。用無水乙醇配制濃度為0.2 mmol/L的DPPH溶液，避光保存，現配現用。配制質量濃度分別為0.001、0.005、0.010、0.020、0.030、0.040 mg/mL 的黑豆種皮花青素溶液，取不同質量濃度待測液0.5 mL，加入0.5 mL配制好的DPPH乙醇溶液，搖勻，室溫避光靜置反應30 min，使用紫外可見分光光度計在517 nm處測量待測溶液的吸光度（A1），設置對照（A2）和空白（A0），以VC為陽性對照。清除率計算公式見“1.2.6.1”。

1.2.6.3 ABTS自由基清除能力

參考林好等[23]的方法。配制試劑Ⅰ：準確稱取0.038 4 g ABTS，用蒸餾水定容至10 mL；配制試劑Ⅱ：稱取0.013 4 g 過硫酸鉀，用蒸餾水定容至10 mL；將試劑Ⅰ與試劑Ⅱ等量混合，避光反應12～16 h 后得ABTS工作液，使用前用無水乙醇稀釋至在734 nm 處測得吸光度為0.70，然后取黑豆種皮花青素配制成質量濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10 mg/mL 的溶液，取0.15 mL 樣品溶液和2.75 mL ABTS 工作液混合均勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中避光反應20 min，使用紫外可見分光光度計在517 nm 處測定待測溶液的吸光度（A1），設置對照（A2）和空白（A0）。清除率計算公式見“1.2.6.1”。

1.2.7 數據處理

數據采用Microsoft Excel 2016 進行分析，并采用Origin Pro 8.5作圖，采用SPSS 22中的ANOVA結合Duncan’s檢驗對不同處理組之間的差異進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 花青素提取單因素試驗結果

2.1.1 乙醇體積分數對花青素提取量的影響

花青素的結構中含有多個羥基，具有很強的極性，因此易溶于水、甲醇、乙醇等極性溶劑[24]。由于本研究是針對花青素在食品中的應用，乙醇的生物毒性低于甲醇，因此試驗選擇不同體積分數的乙醇水溶液進行提取溶劑的優化，結果如圖1所示。當提取劑中乙醇體積分數由40%升高到60%時，花青素提取量隨之升高；在乙醇體積分數為60%時，提取量達到最高，之后花青素提取量呈現出隨乙醇體積分數的增加而降低的趨勢。這可能是由于乙醇體積分數增加，造成極性減小，花青素溶解度降低，且伴隨有大量的醇溶性蛋白質、多糖等大分子物質析出，影響花青素提取量[25]。因此，以體積分數為60%的乙醇溶液為基礎提取溶劑設計正交試驗。

圖1 乙醇體積分數對花青素提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of anthocyanin

2.1.2 料液比對花青素提取量的影響

由圖2 可見，隨著提取溶劑用量的增加，花青素提取量逐漸提高，料液比為1∶20（g/mL）時達到最高，之后逐漸降低。花青素從細胞中溶出是通過擴散作用實現，當提取溶劑用量增加時，黑豆種皮細胞內外濃度差變大，擴散作用增強，花青素提取量增加[26-27]，但提取溶劑過多時，花青素在后續的富集濃縮過程中損失增加，導致提取量下降。因此，以1∶20（g/mL）為基礎料液比設計正交試驗。

圖2 料液比對花青素提取量的影響Fig.2 Effect of material to solvent ratio on the extraction of anthocyanin

2.1.3 提取時間對花青素提取量的影響

較長的提取時間有助于溶劑和樣品之間的相互作用，提高花青素提取量，但過長的提取時間易導致花青素在空氣中氧化分解，提取量隨之下降，同時也會造成資源的浪費。如圖3所示，黑豆種皮經過微波處理之后，花青素更加容易溶出，在30 min時大部分花青素已經溶出，之后花青素提取量隨著時間的延長而有所降低。因此，以30 min 為基礎提取時間設計正交試驗。

圖3 提取時間對花青素提取量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of anthocyanin

2.1.4 微波時間對花青素提取量的影響

微波提取是通過偶極子旋轉和離子傳導同時作用于分子以實現花青素輔助提取。在微波作用過程中，它的能量可以被分子全部吸收，極性分子吸收能量后會破壞細胞結構，在熱傳遞的輔助下有助于目標提取物的傳質和溶出[28-29]。微波既可以節省提取時間，又能減少提取溶劑的使用量[30]。因此本試驗采用微波對黑豆種皮進行預處理以提高花青素的提取量。如圖4所示，當微波時間為10～30 s時，花青素提取量隨時間的延長而升高，在30 s 時提取量最大，這是因為分子在微波中產生瞬時極化的同時迅速生成大量的熱，造成細胞破裂，細胞液隨之溢出并擴散至溶劑中。當微波時間繼續增加時，花青素提取量則有所降低。長時間的微波處理會破壞花青素的結構，影響提取量。因此以30 s為基礎微波處理時間設計正交試驗。

圖4 微波時間對花青素提取量的影響Fig.4 Effect of microwave time on the extraction of anthocyanin

2.1.5 提取溫度對花青素提取量的影響

溫度升高能夠改變細胞膜的流動性，加速分子運動，導致細胞膜穩定性降低，使細胞容易破碎，因此在提取過程中適當的加熱能夠提高花青素的提取效率[31]。如圖5 所示，隨著提取溫度的升高，花青素的提取量逐漸提高，適當的加熱可以促進花青素的提取，但溫度過高會破壞花青素的結構，影響其生理活性，因此在此試驗結果的基礎上，選擇了30、40、50、60 ℃進行正交試驗。

圖5 提取溫度對花青素提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction of anthocyanin

2.2 花青素提取正交試驗結果與分析

正交試驗結果如表2所示，由極差分析可知，各因素對黑豆種皮花青素提取量影響的主次順序為：C＞D＞E＞A＞B。由表2可知，最高花青素提取量的組合為A4B2C3D4E2，即提取溫度60 ℃，提取時間30 min，微波時間30 s，乙醇體積分數70%，料液比1∶15（g/mL），經3次驗證試驗，得到該最優組合下黑豆種皮中花青素平均提取量為29.5 mg/g，高于正交試驗中各組合。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of orthogonal test

2.3 不同提取溫度對花青素抗氧化活性的影響

花青素的主要生理功能是抗氧化，因此在以花青素提取量為評價指標的同時還需要考慮提取條件對花青素抗氧化能力的影響，尤其是溫度對花青素的結構可能產生破壞，因此在本試驗中選擇了3個指標對不同溫度下提取的花青素進行抗氧化能力的評價，包括羥基自由基清除能力、DPPH 自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力。

2.3.1 花青素對羥基自由基的清除能力

羥基自由基是生物體內活性最強的自由基，能夠攻擊體內的生物大分子，導致體內多種疾病的發生。以VC作為對照，花青素對羥基自由基的清除能力如圖6 所示?；ㄇ嗨貙αu基自由基有一定的清除能力，在一定范圍內存在量效關系，花青素質量濃度越高，清除能力越強。在低濃度時清除能力與VC無顯著差異，隨著濃度的增加，對羥基自由基的清除能力低于VC。在試驗的質量濃度范圍內，不同溫度下提取的黑豆種皮花青素的羥基自由基清除能力由大到小排序為：40 ℃＞50 ℃＞60 ℃。結果表明，在溫度較低的條件下提取的花青素對羥基自由基的清除能力更強。

圖6 不同提取溫度所得花青素對羥基自由基的清除作用Fig.6 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on hydroxyl free radicals

2.3.2 花青素對DPPH自由基的清除能力

以VC為對照，黑豆種皮花青素對DPPH自由基的清除能力如圖7 所示。在質量濃度低于0.02 mg/mL時，黑豆種皮花青素對DPPH 自由基的清除率比VC高。但不同溫度下提取的黑豆種皮花青素對DPPH自由基的清除能力無顯著差異。

圖7 不同提取溫度所得花青素對DPPH自由基的清除作用Fig.7 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on DPPH free radicals

2.3.3 花青素對ABTS自由基的清除能力

黑豆種皮花青素對ABTS 自由基的清除能力如圖8所示。黑豆種皮花青素質量濃度對ABTS自由基的清除能力存在一定的量效關系，在一定范圍內，質量濃度越高清除能力越強，且40 ℃下提取的黑豆種皮花青素對ABTS 自由基的清除能力強于50 ℃和60 ℃，且在試驗濃度范圍內，40 ℃條件下提取的黑豆種皮花青素最先達到最高清除率（98.71%）。結果表明，黑豆種皮花青素對ABTS自由基有很強的清除能力，且提取溫度越低，其清除能力越強。

圖8 不同提取溫度所得花青素對ABTS自由基的清除作用Fig.8 The clearing effect of anthocyanins extracted at different temperatures on ABTS free radicals

花青素在較高溫度下會發生分解，影響其抗氧化活性，降低其應用價值[19-21]。通過對不同提取溫度下得到的花青素抗氧化能力的評價，發現40 ℃提取的黑豆種皮花青素對羥基自由基和ABTS 自由基的清除能力更強，因此選擇40 ℃作為最終的提取溫度。在此溫度下黑豆種皮花青素提取量為25.3 mg/g。

3 結論

本研究以黑豆種皮為原料，以花青素提取量和花青素抗氧化活性為考察指標，優化了黑豆種皮中花青素的提取條件。通過單因素試驗和正交試驗，分析了微波時間、料液比、乙醇體積分數、提取時間和提取溫度對黑豆種皮中花青素提取量的影響，并優化了最佳提取條件。通過黑豆種皮花青素抗氧化性試驗結果發現，不同溫度下提取的花青素抗氧化能力存在差異，在相同花青素質量濃度下，對羥自由基和ABTS自由基的清除能力由大到小排序為：40 ℃＞50 ℃＞60 ℃。最終確定微波輔助提取黑豆種皮花青素的最佳工藝為：乙醇體積分數70%，料液比1∶15（g/mL），微波功率350 W，微波時間30 s，提取時間30 min，提取溫度40 ℃，此條件下花青素的提取量為25.3 mg/g。微波輔助提取黑豆種皮花青素具有溫度低、時間短、效率高等優點。本研究可為黑豆中花青素的開發應用以及工業化生產提供理論依據。