干腌魚揮發性風味物質分析方法的建立與優化

陳方雪，王世哲，邱文興，熊光權，喬 宇,*，吳文錦，汪 蘭

（1.湖北省農業科學院農產品加工與核農技術研究所，湖北 武漢 430064；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

武昌魚（Megalobrama amblycephala），學名團頭魴，俗稱鳊魚等[1]。武昌魚是我國所特有的優良淡水魚類，常用來制作干腌魚類產品。干腌魚制品咸香適宜、風味獨特，是我國傳統的水產加工食品之一[2-3]。干腌魚的特殊香氣形成機理復雜，其氣味可以作為區分不同地區干腌魚的指標。干腌魚特征香氣物質多為醛、醇、酮、呋喃化合物等。己醛、壬醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、戊醇被認為是干腌魚的特征風味物質[4]。香氣物質大多是微量或痕量成分，給分析帶來了一定的困難，每一種分析方法和分析環境都會對分析結果造成一定的影響。不同的分析條件都有一定的優點和缺陷，不能真實和全面反映樣品的香氣組成，因此分析與比較不同的揮發性物質分析方法，多種方法相互補充，可以較為真實地反映樣品的實際香氣組成[5]。

固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）屬于非溶劑型選擇性萃取法，是一種集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體的分析技術。該樣品前處理技術簡便且環保，靈敏度高，可實現納克級別的檢測。在萃取過程中，探針涂層的種類和性質起重要作用，決定揮發性物質萃取分配系數的大小[6-8]。攪拌棒吸附萃?。╯tir bar sorptive extraction，SBSE）具有固定相體積大、萃取容量高、無需外加攪拌子、可避免競爭性吸附、能在自身攪拌的同時實現萃取富集等優點，在樣品前處理中具有廣闊的應用前景[9-10]。動態頂空萃取（dynamic headspace extraction，DHS）從理論上講是用流動氣體將樣品中的揮發性成分“吹掃”出來，再用一個捕集器將吹掃出來的有機物吸附，隨后經熱解吸將樣品送入氣相色譜儀進行分析[11-12]。

徐永霞等[13]使用3 種不同SPME萃取探針對大菱鲆魚的揮發性化合物萃取效果進行分析，其中使用二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxy/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭檢測出的揮發性物質總峰面積最大且種類最多。楊雪玲等[14]通過不同SPME萃取溫度、萃取時間、飽和食鹽水與魚肉的比例和探針解析時間分析最適合加州鱸魚的揮發性化合物鑒定條件。加工后的干腌水產品氣味相較于新鮮水產品更加豐富[15]。目前對于干腌魚揮發性化合物鑒定的方法建立與優化較為單一，多為不同的萃取方式和萃取溫度與時間。分析方法和分析環境均會對分析結果造成影響[16]。對于干腌魚揮發性化合物的鑒定，萃取時頂空瓶、色譜柱、萃取探針、萃取溫度等多方面的優化條件相關報道較少。

本研究為全面分析干腌魚揮發性風味物質，選用不同涂層的萃取探針、不同萃取方式（SPME、SBSE、DHS）、不同規格頂空瓶、不同萃取溫度萃取干腌武昌魚中易揮發性成分，在DB-WAX、HP-INNOWAX、DB-1 3 個色譜柱上進行氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）分析。根據不同條件下的萃取及分離揮發性物質種類和豐度，篩選并建立合適的分析條件。旨在為干腌魚風味研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮武昌魚、食鹽、白糖、白酒購于湖北省武漢市悅聯商業悅活里超市。

1.2 儀器與設備

不同類型涂層纖維的萃取頭（50/30 μm DVB/CAR/PDMS，50/30 μm CAR/PDMS）、SPME手柄（57330-U）美國Supelco公司；7890A-5975C GC-MS儀、色譜柱（DB-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、HPINNOWAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）、DB-1色譜柱（60 m×0.25 mm，0.25 μm）） 美國Agilent公司；DF-4046恒溫加熱磁力攪拌器 長城科工貿易有限公司；樣品頂空瓶（20 mL矮頂空瓶、20 mL高頂空瓶、100 mL頂空瓶）、聚四氟乙烯/硅膠隔墊頂部開口式鉗口鋁瓶蓋（27375） 美國Sigma-Aldrich公司；磁力攪拌轉子（1 cm） 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料處理

腌制：準確稱取整魚質量2%的食鹽、1%的糖和0.5%的白酒（酒精度42%）均勻涂在魚的全身；將魚整齊地平鋪在不銹鋼盆中，放入4 ℃冰箱中腌制；每24 h上下翻動1 次，總共2 d。

干制：腌制后，洗去魚表面的鹽分及液體，用不銹鋼鉤橫向刺穿魚體使其展平懸掛；將魚暴露在室外自然環境中進行傳統日曬干制，干制時長為每日8∶00—17∶00，共計4 d，其余時間放置于4 ℃的冰箱中直至干制結束，干制時間為2022年2月11—14日，平均溫度10.3 ℃，相對濕度57%，風速2.91 m/s。

1.3.2 萃取條件

取干制后魚背部的肉，剁碎并均勻混合，稱取3 g混合的樣品于頂空瓶中，然后將頂空瓶進行密封處理。密封好的頂空瓶置于磁力攪拌器中平衡15 min，萃取時間為30 min，探針萃取深度為1 cm。所有萃取條件重復測定3 次，結果取均值。

1.3.3 色譜條件

載氣氦氣的恒定流速為1.0 mL/min，進樣器溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃。柱箱程序升溫參數如下：烘箱初始溫度為40 ℃，不保持，以2 ℃/min的速率升至100 ℃，然后以5 ℃/min的速率升至180 ℃，最后在8 ℃升至250 ℃/min，保持5 min。涂層纖維在進樣口250 ℃下解吸5 min，不分流。

1.3.4 質譜條件

電子轟擊離子源，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，傳輸線溫度250 ℃，離子源溫度230 ℃，母離子m/z285，質量掃描范圍30～400 u，全掃描模式。

1.3.5 定性與定量分析

依據上述條件對樣品進行色譜掃描，質譜通過人工解析與NIST 17譜庫中的標準物質譜圖進行對比，初步確定檢測出的化合物（匹配度＞80）。以峰面積表征揮發性化合物的含量，在不同萃取方式中采用內標法半定量揮發性化合物含量。加入50 μL 0.8 μg/mL 2-辛醇到2 g魚肉樣品中作為內標，通過2-辛醇峰面積和含量的比值計算待測揮發物的含量。

1.4 數據處理

結果數據采用Excel計算均值，Origin進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 不同萃取頭與萃取溫度對干腌魚中揮發性物質測定的影響

由表1可知，4 種萃取方式共檢測到85 種揮發性化合物，其中40、90 ℃下的CAR/PDMS和DVB/CAR/PDMS探針分別萃取到12、35、18、46 種揮發性化合物。在干腌魚中檢測到的揮發性化合物主要以醛、醇、酮類化合物為主。值得注意的是，CAR/PDMS相對DVB/CAR/PDMS萃取探針測得的醛類、酮類和烴類物質較少，醛類和酮類多為不飽和醛和不飽和醇。CAR/PDMS相對DVB/CAR/PDMS萃取頭未檢測出干腌魚的典型香氣物質1-辛烯-3-醇、2,3-辛二酮、反-2,4-癸二烯醛。這通常根據待測物和分析物的性質，依據“相似相容”的規律，分析物若是極性的，萃取頭的涂層（也就是固定相）同為極性的檢測效果更好（如聚丙烯酸酯）；分析物為非極性的，涂層就應該是非極性的（如PDMS），這樣萃取頭的萃取效率比較高。檢測揮發物或半揮發性混合物沸點較高時，需要加熱才能使物質氣化在頂部。90 ℃萃取溫度相較于40 ℃萃取溫度下，醇類、酮類物質減少，醛類、烴類增多，對于DVB/CAR/PDMS萃取頭，溫度差增加的多為C12～C15的甲基衍生物。這個現象可能是由于溫度過高加速氧化自由基斷裂，生成了多種醛類和烴類物質。

表1 不同萃取探針在不同溫度下對干腌魚揮發性物質測定的影響Table 1 Effect of different extraction probes on the determination of volatiles in dried-cured fish at different temperatures

2.2 不同頂空瓶體積對干腌魚中揮發性物質測定的影響

正確選擇合適的頂空瓶是為了達到理想的測定條件與頂空GC狀態。由表2可知，3 種頂空瓶分別檢測到干腌魚中揮發性化合物23、13、28 種。其中100 mL頂空瓶檢測到的揮發性化合物種類最多，其次是20 mL矮瓶頂空瓶，但在20 mL高頂空瓶中檢測到的揮發性化合物豐度均高于100 mL頂空瓶和20 mL矮頂空瓶。這可能是由于頂空樣品瓶能夠承受來自氣體的壓力，且不同頂空體積的樣品瓶頂空部分壓力不同。同時因為分析靈敏度取決于待測組分在頂空氣體中的濃度，而不是樣品量。固體樣品因為樣品本身的體積較大，所以在較大的頂空樣品瓶中檢測效果更好。

2.3 不同色譜柱對干腌魚中揮發性物質測定的影響

由表3可知，干腌武昌魚在3 種色譜柱上共檢測出45 種揮發性化合物，在DB-WAX、HP-INNOWAX和DB-1色譜質上分別檢測到27、14、24 種揮發性化合物。己醛、壬醛、辛醛、1-辛烯-3-醇、戊醇等干腌魚特征香氣物質在DB-WAX和HP-INNOWAX色譜柱上均檢出，且在DB-WAX色譜上有更好的檢測效果。DB-1為非極性色譜柱，DB-WAX和HP-INNOWAX為強極性色譜柱，雖然極性并不直接與選擇性相關，但是會影響化合物保留及分離。固定相選擇性和極性概念通常用來表征色譜柱分離物質的屬性。選擇性取決于溶質和固定相分子的物理化學相互作用力。極性取決于固定相的結構且對分離有影響[17-19]。選擇性可以認為是固定相在區分2 種溶質分子在其化學或物理性質方面的差異能力。如果固定相和溶質間的相互作用力不同，則可分離[20]。所有聚硅氧烷和聚乙二醇固定相之間最主要的相互作用力就是色散力[21]。色散力可以簡化為揮發性的概念，簡而言之，溶質的揮發性越好，從色譜柱中流出的速度就越快，即保留時間更短[22]。在2 種強極性色譜柱中，有較多的醛類、醇類和酮類物質被分離出，而在DB-1色譜柱中有較多的烷烴類化合物被分離出來。醛、醇、酮為干腌魚中主要的揮發性風味物質，且有較低的閾值，對干腌魚整體氣味有較大的影響。所以根據結果可以看出，強極性色譜柱更適合用于干腌魚揮發性化合物的檢測中，其中DB-WAX色譜柱分離效果最好。

表3 不同色譜柱對干腌武昌魚揮發性物質測定的影響Table 3 Effect of different chromatographic columns on the identification of volatile compounds in dry-cured fish

2.4 不同萃取方式對干腌魚中揮發性物質測定的影響

由表4可知，DHS萃取到的揮發性化合物種類最多，揮發性物質種類排序為：DHS＞SPME＞SBSE。如DHS萃取到的C4～C6的醛類物質相比SPME和SBSE種類要多，SPME萃取到的C6～C10的醛類更多，SBSE萃取到的C10～C16的醛類較多。醇類物質的含量DHS＞SPME＞SBSE，DHS萃取到的醇類化合物高達12 種，主要以飽和醇為主，而SPME萃取到的不飽和醇種類更多，這些不飽和醇多為魚肉的腥味來源，都有較低的閾值。DHS和SBSE未萃取到酮類物質。SBSE的磁子是一種特殊的以PDMS為外層覆膜的磁性攪拌轉子。按照磁子形狀不同其吸附體積介于20～130 μL。與之相比，SMPE纖維的吸附體積則僅為0.5 μL，其優勢在疏水性有機物方面更加明顯。SBSE對樣品中揮發性化合物的提取濃度較高于SPME和DHS。但在本研究結果中，SBSE對固體魚肉樣品揮發性化合物種類的萃取效果與SPME和DHS相比較低。SPME和DHS都無溶劑干擾，如圖1所示，SBSE萃取時峰較雜。但DHS易受樣品基質干擾。所以對于干腌魚揮發性化合物的測定更適合將多種萃取方式結合使用，更全面地分析其香氣成分。

圖1 不同萃取方式下干腌武昌魚離子流圖Fig. 1 Ion current chromatograms of volatile components from drycured fish using different extraction methods

表4 不同萃取方式對干腌武昌魚揮發性物質鑒定的影響Table 4 Effects of different extraction methods on the identification of volatile compounds in dry-cured fish

醛類被證實是干腌魚的主要揮發性成分，是干腌魚的獨特風味成分之一。己醛在干腌魚的總揮發性化合物中含量最高。己醛在這些揮發性醛類中占主導地位[23]。Zardin等[24]給出了相應的解釋，稱己醛是唯一由亞油酸酯的9-和13-氫過氧化物以及亞油酸酯氧化過程中形成的其他不飽和醛產生的醛類。大部分的線性醛來自于脂肪的氧化反應。在干腌武昌魚中，壬醛和辛醛含量僅次于己醛，主要來自油酸、亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸的分解。3-甲基丁醛主要由亮氨酸和異亮氨酸通過Ehrlich反應（Strecker降解路徑）形成，僅在干制后的魚肉中檢出[25]。

干腌魚肉中存在多種類型的醇類化合物。醇類通常來源于脂質氧化和糖類、氨基酸和羰基化合物的還原[26]。與飽和醇相比，不飽和醇的氣味閾值較低，對干腌魚的整體香氣貢獻更大[27]。1-辛烯-3-醇通常被描述為泥土味、蘑菇味、草味和魚腥氣味，它是由12-脂氧化酶氧化花生四烯酸形成的，1-戊烯-3-醇可能是由15-脂氧酶對EPA的作用形成的[28]。甲基支鏈醇可能來源于氨基酸Strecker降解[29]。據報道，1-戊醇和1-己醇在魚產品的香氣中起著重要作用，1-戊醇和1-己醇具有腥味[30]。

酮類化合物是氧化的最終產物之一[31]。干腌魚的干燥過程會導致脂質降解，促進一些脂肪酮的形成[32]。然而，酮類氣味閾值普遍較高，對魚干的整體香氣沒有明顯貢獻[33]。酯類、酸類和雜環類揮發物有助于形成干腌魚的獨特風味。酯類通常由短鏈游離脂肪酸與醇的酯化作用或甘油三酯與乙醇的酯化作用形成[34]。

3 結 論

本研究通過對比不同萃取溫度、SPME萃取探針、頂空瓶、色譜柱和不同萃取方式的分析條件，結合干腌魚揮發性化合物的種類和峰面積對比干腌魚的特征風味成分己醛、庚醛、辛醛、壬醛、1-戊烯-3醇、1-戊醇、己醇和1-辛烯-3醇對其分析條件進行優化。結果表明：較高的萃取溫度更利于樣品中的揮發性和非揮發性化合物被萃取，但同時也存在熱反應產生的新揮發性化合物，所以選擇萃取溫度不易過高；三相SPME探針DVB/CAR/PDMS的萃取效果最好，根據化合物的極性與非極性能更好吸附樣品中的揮發性化合物；頂空瓶的選擇應當考慮樣品的體積，本實驗中固體干樣的樣品更適合于體積較大的頂空瓶，使得在頂空部分揮發性化合物能更好地被萃取；極性色譜柱能更好地分離干腌魚中的揮發性化合物且有較好的重現性，干腌魚樣品中的主要揮發性風味物質醛、醇和酮能更好地被分理出來，其中DB-WAX色譜柱的檢測結果中有較多的醛、醇類化合物，但能更有效檢測樣品中的揮發性化合物應當考慮結合使用極性色譜柱和非極性色譜柱；SPME、SBSE和DHS 3 種萃取方式萃取的揮發性化合物有顯著差異，其中DHS萃取到的干腌魚揮發性化合物種類最多，SBSE萃取到的揮發性化合物種類最少，SPME萃取揮發性風味物質最高效、快速。SPME和DHS更適用于干腌魚揮發性化合物的萃取，但在風味分析中也應當結合使用多種萃取方式，更加準確地鑒定樣品種的揮發性物質。