神經(jīng)介素U蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌中表達的意義及作用機制

高關清，郭丹，盧文亞，張萍，王芳，石科

（1.河南省第二人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，鄭州 451191；2.河南醫(yī)學高等專科學校生物化學與醫(yī)學遺傳學教研室，鄭州 451191；3.河南省第二人民醫(yī)院普外科，鄭州 451191）

甲狀腺癌是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，預后通常較好[1]。與其他類型的腫瘤類似，甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷對提高生存率很重要。目前多種生物標志物和不同療法成功用于甲狀腺乳頭狀癌的診斷和治療[2-4]。然而，闡明甲狀腺乳頭狀癌轉(zhuǎn)移的分子機制對于開發(fā)新的甲狀腺乳頭狀癌治療方法至關重要。

神經(jīng)介素U（neuromedin U，NMU）蛋白是人體內(nèi)源神經(jīng)調(diào)節(jié)肽家族的重要成員，能夠通過激活人體中樞和外周組織的神經(jīng)介素U 受體1（NMU receptor 1，NMUR），發(fā)揮多樣而復雜的生理功能[5]。NMU 是參與人體胃腸道免疫調(diào)節(jié)的重要角色，已有大量研究證實了它與炎癥發(fā)生以及先天淋巴細胞的活性調(diào)控息息相關[6]。NMU 激活NMUR 后通過調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周胃腸道運動兩條途徑來實現(xiàn)對能量平衡的調(diào)節(jié)[7]。

研究顯示，NMU 具有控制腫瘤進展的能力，并且有可能成為監(jiān)控腫瘤發(fā)生與進展的標志物。NMU表達升高或降低與腫瘤細胞遷移、侵襲、糖代謝、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、維持腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）表型等密切相關，進而影響腫瘤的免疫反應、藥物敏感性和治療效果等[8]。結(jié)直腸癌細胞分泌的NMU 能在表達NMUR2 受體的CRC 細胞中誘導侵襲性表型[9]。NMU 也是肺腺癌患者預后不良的生物標志物[10]。然而NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達及對其潛在影響仍然未知。本研究主要探討NMU 蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達及臨床意義及對細胞增殖的影響。

1 材料和方法

1.1 基因表達GEPIA 分析 在線軟件GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn/detail.php?gene=NMU）是基于基因表達數(shù)據(jù)和腫瘤基因組圖譜RNA 序列而建立的程序，本研究采用GEPIA 檢測甲狀腺癌和正常甲狀腺標本中NMU mRNA 水平，及其在不同類型腫瘤中的表達。NMU 在甲狀腺癌中的表達在expression DIY（The Boxplot TAB）中顯示，截斷標準為log2FC>1 和P<0.01。

1.2 臨床資料 收集2016 年3 月—2022 年3 月河南省第二人民醫(yī)院71 例甲狀腺乳頭狀癌患者手術切除的腫瘤及正常組織標本，分析其臨床病理資料特征。全部病例均經(jīng)過病理證實，術前未經(jīng)化療或放療，且具有完整的病例資料。收集患者的一般臨床資料，包括年齡、性別、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腺內(nèi)傳播等。71 例甲狀腺乳頭狀癌患者年齡43～65 歲，平均年齡（57.5±5.75）歲；男性14 例，女性57例；腫瘤分期低級別者29 例，高級別者42 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移未轉(zhuǎn)移者28 例，轉(zhuǎn)移者48 例；多灶者33 例，單灶者38 例。

1.3 試劑 NMU 抗體為兔抗人單克隆抗體（ab2296335、abcam、Cambridge），β-肌動蛋白（βactin）抗體（1∶1 000 稀釋，ab8226、abcam）。免疫組化稀釋濃度為1∶100，免疫印跡稀釋濃度為1∶1 000；免疫組化二步法檢測試劑盒（PV-6001）、DAB 顯色試劑盒（ZLI-9018）均購于北京中衫金橋生物技術有限公司；噻唑藍（methylthiazoly tetrazolium，MTT）購自美國Sigma-Aldrich 公司。

1.4 方法及免疫組化染色結(jié)果的評分標準 甲狀腺乳頭狀癌腫瘤及正常的組織進行福爾馬林固定，并用石蠟全包埋，包埋后的蠟塊標本行5 μm 切片及免疫組化染色，抗體1∶100 稀釋。切片于75℃孵育30 min 后，二甲苯脫蠟及梯度乙醇水合。檸檬酸緩沖液孵育20 min 后5% BSA 于室溫封閉30 min。封閉后NMU 抗體孵育2 h，二抗孵育1.5 h，通過DAB 法顯色，隨后蘇木素染色。組化切片于蔡司顯微鏡下拍照。

評分標準：陽性細胞比例：陽性細胞數(shù)<20%為0 分；陽性細胞百分率為20%～50% 記1 分；腫瘤細胞陽性百分率為50%～70% 記2 分；腫瘤細胞陽性百分率＞70%則為3 分；同時對陽性著色細胞的染色強度進行評分：陰性表達記0 分，弱陽性表達記1 分，中等陽性2 分，強陽性記為3 分；最終計分結(jié)果為陽性細胞比例分數(shù)加染色強度分數(shù)，范圍為0～6 分。0～2 分為NMU 低表達，3～6 分為NMU 高表達。

1.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 甲狀腺乳頭狀癌的細胞系TPC-1 和KTC-1 細胞購自美國模式菌種收集中心（ATCC）。shRNA 質(zhì)粒購自Addgene。TPC-1 和KTC-1細胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美國Gibco 公司）的RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）中進行培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進行。細胞實驗分為對照組（轉(zhuǎn)染對照shRNA 質(zhì)粒）及NMU 下調(diào)組（轉(zhuǎn)染NMU 的shRNA 質(zhì)粒），實驗所用質(zhì)粒購自Charles River 公司，貨號SH814099，序列如下：CCGC TCCTGCTGCTGCTGCTGCT。取2 mL 滅菌的EP 管加入質(zhì)粒或Lipo2000 和1.5 mL Opti-MEM 培養(yǎng)基，室溫孵育5 min。隨后兩者混合后孵育20 min，加入細胞培養(yǎng)基中，6 h 后換液，24 h 后進行功能實驗。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）實驗 利用RIPA 細胞裂解液提取細胞總蛋白，使用BCA 法測量蛋白濃度。加入蛋白酶抑制劑后，將總蛋白進行10%SDS-PAGE 電泳后，轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯（PVDF）的膜上，5%脫脂奶粉進行室溫固定2 h，室溫條件下NMU 一抗（1∶1 000）孵育2 h，隨后Tris-HCL 緩沖液（TBST）洗脫未結(jié)合抗體，共洗5 次，每次5 min；隨后室溫山羊抗兔二抗（1∶3 000）孵育45 min，TBST洗脫未結(jié)合抗體，共洗5 次，每次5 min，加入ECL增強顯影底物后在曝光儀中檢測信號，所得信號使用Image J 8.0 軟件進行分析。

1.7 實時定量熒光PCR 通過TRIzol 試劑提取HUVEC 細胞內(nèi)總RNA，并進行兩步法反轉(zhuǎn)錄，條件為42℃，1 h，所得cDNA 通過SYBR 熒光探針進行實時定量聚合酶鏈式反應（PCR），并使用β-actin 作為內(nèi)參，檢測相關mRNA 的表達水平。實驗結(jié)果采用2×δCT 法進行定量。NMU 正向：5′-AGT TGT GGA ATG AGG CAT CC-3′，反向：5′-GGA TGC ACA ACT GAC GAC AC-3′；β-actin：正向5′- GCA CTC TTC CAG CCT TCC TT-3′，反向：5′- GTT GGC GTA CAG GTC TTT GC-3′。以2-△△CT公式計算出β-actin 和NMU 相對表達量。

1.8 MTT 實驗 細胞鋪于96 孔板中，進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理后于48 h 加入40 μL 的MTT 試劑，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h，應用200 μL 的DMSO 震蕩溶解，隨后在570 nm 波長下使用多功能酶標儀檢測其吸光度值。每組實驗設3 個重復，統(tǒng)計結(jié)果。

1.9 集落形成實驗 細胞進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染處理后48 h鋪于6 孔板中，每孔約1 000 個細胞，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)14 d，隨后使用0.2%的結(jié)晶紫染色15 min，使用4%多聚甲醛室溫固定20 min，流水緩慢沖洗，隨后奧林巴斯熒光顯微鏡下觀察拍照，使用Image J 8.0軟件分析圖片。

1.10 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計學處理采用Graphpad 8.0軟件。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)采用±s 表示。通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析NMU mRNA 在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達。通過卡方檢驗比較臨床病理特征與患者腫瘤組織NMU 表達的相關性，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 生物信息學分析揭示NMU 的mRNA 在甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中高表達且與患者預后相關 首先通過GPEIA 數(shù)據(jù)庫分析NMUmRNA 水平在512 例人甲狀腺乳頭狀癌組織及對應的337 例正常組織中的差異，發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織中NMU mRNA呈顯著高表達（圖1A，P=0.006）。且生物信息學分析結(jié)果證實甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織NMU 的表達與患者無病生存率顯著相關（圖1B，P=0.021）。

圖1 NMU 的mRNA 水平在甲狀腺癌中顯著增加并與患者不良預后顯著相關Fig 1 mRNA levels of NMU are significantly increased in thyroid cancer and are significantly associated with poor prognosis in patients

2.2 NMU 蛋白在甲狀腺乳頭狀癌患者腫瘤組織中高表達并與患者臨床病理特征顯著相關 將腫瘤組織按NMU 的表達水平分為高表達組與低表達組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相對于正常組織，NMU 蛋白在人甲狀腺乳頭狀癌組織中呈顯著高表達（圖2）。

圖2 NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中的表達水平Fig 2 The expression levels of NMU in thyroid papillary carcinoma

對染色結(jié)果進行評分量化分析，結(jié)果證實，NMU 表達水平與甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤分期（P=0.004）及多灶情況等（P=0.006）密切相關，而與其他的臨床特征，包括年齡（P=0.461）、性別（P=0.422）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.938）等無顯著相關性（表1）。

表1 71 例甲狀腺乳頭狀癌患者NMU 的表達水平與臨床病理特征相關性分析[n（ %）]Tab 1 Correlation analysis between NMU expression levels and clinical pathological characteristics in 71 patients with papillary thyroid cancer[n（ %）]

2.3 下調(diào)NMU 蛋白抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖 與對照組相比，NMU 下調(diào)組TPC-1 和KTC-1細胞NMU 的mRNA 及蛋白水平均顯著下降（t=7.96、7.37、10.42、7.69，均P＜0.05），見圖3。

圖3 NMU 的shRNA 在甲狀腺乳頭狀癌細胞系TPC-1 和KTC-1中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of NMU in thyroid papillary cancer cell lines TPC-1 and KTC-1

集落形成實驗結(jié)果表明，在TPC-1 和KTC-1細胞中，NMU 蛋白的下調(diào)會導致形成集落的數(shù)量下降（圖4A，t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）。MTT 實驗結(jié)果表明，在TPC-1 和KTC-1 細胞中，NMU 蛋白下調(diào)后TPC-1 和KTC-1 細胞平均吸光度值均下降（圖4B，t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）。

圖4 NMU 下調(diào)抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖Fig 4 NMU down-regulation inhibited the proliferation of thyroid papillary cancer cells

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌是最為常見的一種甲狀腺癌，其生長緩慢，惡性程度低，預后通常較好。其發(fā)生會受到輻射、激素、遺傳、環(huán)境及炎癥等因素的影響。由于甲狀腺乳頭癌對放化療不敏感，因此靶向治療便成了最有潛力的一種治療手段[11]。然而截至目前，甲狀腺乳頭狀癌的治療靶點有限。為了進一步提高患者的生存率，仍需發(fā)現(xiàn)新的更有效的治療靶點。NMU 在多種腫瘤中均出現(xiàn)高表達并與不良預后相關，因此進一步借助ProteinAtlas 驗證NMU mRNA在多種腫瘤中與患者預后的相關性。在本研究中發(fā)現(xiàn)，NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中顯著高表達，并與患者的無病生存期顯著相關，提示不良預后。進一步的臨床病理特征分析證實NMU 的表達與患者的腫瘤分期及多灶情況密切相關，而這兩種特征均與甲狀腺乳頭狀癌的轉(zhuǎn)移有關。因此推測NMU 可能參與甲狀腺乳頭狀癌的進展和轉(zhuǎn)移，是一個甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點和標志物。

為了證實推測，進一步利用兩種甲狀腺乳頭狀癌的細胞系開展體外實驗。通過轉(zhuǎn)染NMU 的shRNA 質(zhì)粒，下調(diào)NMU 的表達，并通過集落形成實驗和MTT 實驗檢測其對細胞增殖的影響，結(jié)果表明，NMU 的下調(diào)顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖。因此，研究初步揭示了NMU 在甲狀腺癌中的功能。NMU 表達水平的改變能夠影響癌細胞的多種功能，如增殖、遷移、侵襲、代謝、EMT 等，進而影響腫瘤免疫、藥物敏感性和治療效果[8]。研究表明，結(jié)直腸癌細胞分泌的NMU 能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，促進細胞侵襲[9]。另有研究證實，NMU 在人樹突細胞中表達[12]，而NMUR1 在免疫效應細胞（如T 細胞、NK 細胞）中表達[13]，提示抗原提呈細胞和免疫效應細胞群之間存在相互作用，并進一步提示NMU 可參與腫瘤的免疫治療。

除此之外，NMU 作為一種神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白，也能參與代謝過程，負責調(diào)節(jié)能量消耗、進食行為，維持生命的新陳代謝[14]。而腫瘤的微環(huán)境及腫瘤細胞代謝在甲狀腺癌進展與轉(zhuǎn)移中同樣扮演重要角色[15]，故有理由推測NMU 可能通過調(diào)控甲狀腺腫瘤細胞的代謝影響腫瘤進展。在本研究中，初步發(fā)現(xiàn)NMU對甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖的影響，而對于細胞遷移及代謝等方面的影響仍需進一步體內(nèi)外研究證實。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)了NMU 在甲狀腺乳頭狀癌中顯著高表達，并與患者的無病生存期顯著相關。NMU 的表達水平與甲狀腺癌患者的腫瘤分期及多灶情況密切相關，且NMU 的下調(diào)能夠抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞增殖，提示其可作為甲狀腺乳頭狀癌的潛在治療靶點。