2種腸道菌群檢測技術在小兒抗生素相關性腹瀉中的應用比較

潘淑娟 毛安亮 胡文娟

【摘要】? 目的? ? 對比分析抗生素相關性腹瀉患兒應用傳統糞便菌群培養法檢測與熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）技術檢測的臨床價值。方法? ? 將2021年2月—2022年2月上饒市立醫院收治的50例1～3歲抗生素相關性腹瀉患兒作為觀察對象，分別采用傳統糞便菌群培養和熒光定量PCR技術檢測腸道菌群，觀察對比2種方法的糞便細菌含量檢測結果。結果? ? 與糞便菌群培養檢測比較，熒光定量PCR檢測患兒糞便細菌含量水平更高，差異有統計學意義（P<0.05）。結論? ? 熒光定量PCR技術檢測抗生素相關性腹瀉患兒腸道菌群的效果更佳，可為臨床治療提供更準確的依據。

【關鍵詞】? 抗生素相關性腹瀉；小兒；腸道菌群；熒光定量PCR技術；糞便菌群培養法

Comparison of two detection techniques for intestinal flora in children with antibiotic-associated diarrhea

Pan Shujuan1， Mao Anliang1， Hu Wenjuan2. 1 The Shangrao Municipal Hospital，Shangrao，Jiangxi? ?334000; 2 The Traditional Chinese Medicine Hospital of Shangrao city，Shangrao，Jiangxi? ?334000

【Abstract】? Objective? ? To compare and analyze the clinical value of traditional fecal flora culture and fluorescence quantitative PCR detection in children with antibiotic-associated diarrhea. Methods? ? From February 2021 to February 2022，50 children with antibiotic related diarrhea aged 1-3 years received in our hospital were observed. The intestinal flora was detected by traditional fecal flora culture and fluorescent quantitative PCR，and the fecal bacterial content detection results of the two methods were observed and compared. Results? ? Compared with fecal flora culture，the level of fecal bacteria detected by fluorescence quantitative PCR was higher，and the difference was statistically significant（P<0.05）.? Conclusion? ? Fluorescence quantitative PCR is more effective in detecting intestinal flora in children with antibiotic associated diarrhea，which can provide a more accurate basis for clinical treatment.

【Key Words】? Antibiotic related diarrhea； Children； Intestinal flora； Fluorescence quantitative PCR； Fecal bacterial culture method

中圖分類號：R372? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1672-1721（2023）22-0094-03

DOI：10.19435/j.1672-1721.2023.22.031

抗生素相關性腹瀉是現代臨床應用抗生素治療過程中最常見的一種并發癥，是無法用其他原因解釋且伴隨抗生素使用而發生的一類腹瀉[1]。腹瀉的發生與腸道菌群變化有關[2]，而人體腸道內有數百種不同類型的細菌，厭氧菌位居首位，還有乳酸桿菌、雙歧桿菌等有益細菌以及大腸埃希菌、梭狀芽孢桿菌、綠膿桿菌、葡萄球菌等有害細菌[3]。按照是否有致病菌參與，抗生素相關性腹瀉有感染性、非感染性之分，其中感染性抗生素相關性腹瀉相對少見，與抗生素大量濫用有關，以致于人體腸道內菌群失調，條件致病菌大量增殖，破壞正常菌群，最終引起腹瀉；感染性抗生素相關性腹瀉臨床癥狀相對嚴重，主要病原菌多為艱難梭菌，如果不及時干預，有可能會引起偽膜性腸炎[4]。臨床更常見的非感染性抗生素相關性腹瀉，又被稱之為功能性抗生素相關性腹瀉。相對于感染性抗生素相關性腹瀉而言，非感染性抗生素相關性腹瀉癥狀較輕[5]。為了在臨床進行針對性治療，有必要進行腸道菌群檢測，以提高抗生素相關性腹瀉患兒糞便細菌檢出率，確保治療的高效性、可靠性。常規糞便檢測特異性不足，臨床應用受限。熒光定量PCR技術較為新穎，常被用于腹瀉患兒的腸胃菌群檢測中，能夠輔助臨床早診斷、早治療[6]。本研究納入50例抗生素相關性腹瀉患兒作為觀察對象，對比分析了傳統糞便菌群培養法檢測與熒光定量PCR技術檢測的臨床價值。

1? ? 資料與方法

1.1? ? 一般資料? ? 將2021年2月—2022年2月上饒市立醫院收治的50例抗生素相關性腹瀉患兒作為觀察對象，男性28例、女性22例；年齡1～3歲，平均年齡（2.2±0.8）歲；體質量7～21 kg，平均（13.7±2.2）kg。納入標準：滿足小兒抗生素相關性腹瀉的診斷，入院時無腹瀉；入院前1周未使用任何微生態制劑；無肝腎功能不全；無先天性心臟病、胃腸道畸形、免疫缺陷病等。排除標準：先天性智力障礙或有精神病史者；合并其他重要器官疾病者；主要觀察資料缺失者。分別采用傳統糞便菌群培養法和熒光定量PCR技術檢測患兒腸道菌群。

1.2? ? 方法? ? 糞便菌群培養法檢測。采集患兒新鮮糞便約0.5 g作為檢測標本，置于無菌杯內立即送檢，以0.9％氯化鈉注射液作為稀釋液，對檢測標本進行稀釋，然后使用革蘭球菌、革蘭桿菌接種、培養，進一步涂片操作，詳細觀察、記錄細菌數量；剩余標本用無菌干燥管儲存，-80 ℃冰箱保存備用。

熒光定量PCR技術檢測。（1）提取腸道細菌DNA。將保存于-20 ℃環境下的糞便樣本取出復融之后，每1 g樣本中加入pH值為7.4、0.05 mL/L的磷酸鹽緩沖液（PBS）1 mL，持續顛倒搖晃10 min左右，充分混合均勻，然后離心處理10 min，轉速為2 000 r/min，提取上清液，以上操作反復進行3次。接著再離心處理3 min，轉速為13 000 r/min，獲得沉渣。使用PBS溶液對沉淀物進行4次清洗、1次水洗，結束后加入蒸餾水50 mL，懸浮沉淀物。取1％破碎菌體（TritonX-100）50 mL，在100 ℃高溫下煮沸5 min，之后置于冷凍環境中進行冷卻。（2）選擇PCR引物。主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌4種細菌，引物序列選擇時，在BLAST數據庫中，需與上述不同類別的細菌16SrDNA全序列進行驗證對比，進一步確定不同細菌上下游引物。（3）熒光定量PCR反應體系。以4×dNTP（0.25 mmol/L）2 mL、10×Buffer 2.5 mL、MgCL2（25 mmol/L）2.5 mL等25 mL反應體系為主，細菌上游引物0.2～0.3 mL，細菌下游引物0.2～0.3 mL，DNA模板2 ～3 mL，TAQ酶0.7～0.8 mL，sybrgreen熒光染料2～3 mL，雙蒸水10～12 mL。運用熒光定量PCR儀（SLAN-96P型）進行分析、擴增。（4）PCR反應條件。在95℃環境下持續5 min變性反應；在95 ℃環境下持續反應15 s，在60 ℃環境下持續反應60 s，在72 ℃環境下持續反應45 s，在87 ℃環境下持續反應5 s，總共40個循環。在72 ℃環境下延續10 min，然后結束操作。

1.3? ? 觀察指標? ? 對比2種檢測方法對患兒糞便細菌含量的檢測結果，主要包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌等。

1.4? ? 統計學方法? ? 使用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以x±s表示，行t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2? ? 結果

與糞便菌群培養法檢測比較，熒光定量PCR檢測患兒糞便細菌含量水平更高，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

3? ? 討論

近年來，我國小兒抗生素相關性腹瀉的發生率顯著增加，不同類別的抗生素應用及多種抗生素的聯合應用都會在一定程度上引起抗生素相關性腹瀉，尤其是β-內酰胺類抗生素，需引起臨床醫務人員高度重視 [7]。小兒抗生素相關性腹瀉多發生于應用抗生素初期、停止使用抗生素后2～6周，感染性抗生素相關性腹瀉癥狀表現通常比較嚴重，尤其是真菌感染引起的腹瀉，有可能會導致患兒伴發偽膜性結腸炎，引起全身嚴重感染，主要癥狀包括腹瀉、腹脹、腹部疼痛不適、高熱不退、嘔吐等，甚至引發休克、多器官功能障礙綜合征、低鉀血癥、結腸穿孔、腎功能衰竭，危及患兒生命安全[8]。既往臨床通常采用血生化檢查，有助于臨床醫師準確判斷患兒有無嚴重感染；糞便涂片檢測有助于臨床醫師了解患兒腸道菌群變化，為指導臨床合理使用抗生素、細菌的培養鑒定以及盡早提供準確的鑒定結果至關重要。

隨著現代臨床醫學發展以及相關研究深入，越來越多的研究者認為抗生素相關性腹瀉的發生與腸道菌群變化有關。長時間大量應用廣譜抗生素或者是聯合應用抗生素，雖然具有一定的殺滅細菌作用，但同時也會對正常細菌產生不良影響，以致于人體腸道之中的正常菌群被殺滅、破壞[9]。傳統的常規糞便菌群培養檢測是臨床常用實驗室檢測方法之一，在特定的環境中，用培養基持續培養7 d左右，便可以在顯微鏡下觀察菌群數量、菌群類型，分離出腸道中引起腹瀉的細菌，有助于臨床醫師判斷患兒體內腸道菌群數量的變化，還可以直接觀察到有無真菌，為桿菌與球菌比例、革蘭陰性與陽性桿菌之間的比例評價提供依據，從而進一步明確患兒腸道菌群破壞的嚴重程度，為臨床完善相關治療方案提供參考。雖然此種方法的定性程度較高，但是對抗生素相關性腹瀉患兒而言，特異性不足，如果培養基上微生物分布不均，會導致低估細菌量的情況，尤其是輕微腹瀉的患兒，常規糞便檢查并不會發現任何異常；對于腹瀉癥狀較嚴重的患兒

來說，常規糞便檢測也只能檢出紅細胞、白細胞；定量有待于提高且操作耗時較長[10]；受限于操作方法及腸道菌群中各類細菌生長條件及速率差異，傳統的常規糞便菌群培養鑒定結果準確性不佳。此外，臨床還有多種方法用于糞便菌群檢測，如腸道細菌定量培養主要通過不同的培養基以及培養方法計算腸道菌群數量，以此來評價腸道菌群比例失調情況，雖然此種方法具有較高的應用價值，但是實際操作過程中比較煩瑣、耗時長，加之菌群培養受限，難以在抗生素相關性腹瀉患兒腸道菌群檢測過程中得到廣泛應用；細胞毒性中和試驗（CCTA）特異性強，敏感度高（最低可檢測出10 pg毒素），但需要細胞培養及顯微鏡觀察的相應設備和技術，操作煩瑣，耗時長（48～72 h），判定結果需要一定經驗的技術人員，不適宜臨床常規檢測；核苷酸擴增檢測（NAAT）是一種以RNA為模板擴增出RNA產物，用RNA探針實時檢測的恒溫擴增技術，具有靈敏度高、檢測時間短、產物不易發生污染等優點，但易出現假陽性結果。臨床實踐中迫切需要一種兼顧效率和準確性的檢測方法。

本次研究發現，與糞便菌群培養檢測比較，熒光定量PCR檢測患兒糞便細菌含量水平更高，差異有統計學意義（P<0.05），說明熒光定量PCR檢測的臨床應用價值更高。實時熒光定量PCR是指將熒光基團加入PCR反應體系，使整個進程始終處于熒光信號實時監測中，通過標準曲線對未知模板進行定量分析，避免了常規PCR（瓊脂糖凝膠電泳、熒光素標記PCR產物、三明治探針雜交、毛細管電泳激光誘導熒光）分析時間長、可能會導致污染、對樣本通量的限制較大、易受擴增效率及樣品基質和反應物變化的影響以致準確性較低等弊端，以全封閉反應、速度快、重復性好、靈敏度及特異度高、定量準確等優勢，實時熒光定量PCR在生命科學研究的各個領域得到廣泛應用[11]。隨著臨床檢測的技術不斷發展，16S rDNA熒光定量PCR檢測技術的提出，為現代臨床有效檢測小兒腸道菌群提供了新方法。16S rDNA為與細菌染色體編碼核糖體RNA（rRNA）相對應的DNA序列，于所有細菌中存在而非原核生物體（病毒、真菌等）不具備，基因編碼由通用的保守區和具有種屬特異性的可變區組成，多拷貝使得其具備較高的分子生物學檢測靈敏度，基因編碼長度適中（1 500 bp，含約50個左右的功能域），利于測序，目前幾乎所有細菌的16S rDNA基因測序都已完成，成為臨床最常用的PCR目標擴增序列[12]。16S rDNA基因檢測原理為從細菌樣本中的16S rDNA基因片段中獲取其序列信息，再于數據庫中確定在進化樹中的具體位置，從而鑒別細菌種類。針對16S rDNA基因兼具保守性和特異性的特點，可通過不同的引物設計實現對標本中的靶細菌進行準確鑒定。賀銳等[13]采用16S rDNA熒光定量PCR技術檢測新生兒出生后第1天、第

3天、第7天糞便中雙歧桿菌、乳酸桿菌、大腸埃希菌和腸球菌4種細菌的含量，結果發現上百個細菌的曲線生長特征明顯，說明引物16S rDNA熒光定量PCR檢測不同類型的細菌的敏感性較高。

綜上所訴，相對于傳統糞便菌群培養法檢測技術而言，熒光定量PCR技術檢測抗生素相關性腹瀉患兒腸道菌群含量效果更佳，可為臨床治療提供更準確的依據。

參考文獻

[1] 鐘蕊，林亞瑩，朱毅，等.基于16S rDNA高通量測序研究針灸對克羅恩病大鼠腸道菌群的調節作用[J].世界中醫藥，2022，17（3）：311-316，322.

[2] 梅其杰，徐文飛，延偉偉，等.兔膝骨性關節炎模型腸道菌群的16S rRNA檢測分析[J].中國矯形外科雜志，2022，15（4）：1-5.

[3] LI L J，YAN Q Q，MAN，et al.Analysis of intestinal flora and inflammatory cytokine levels in children with non-infectious diarrhea[J].Transl Pediatri，2021，10（5）：1340-1345.

[4] 王廣宇，陳瀟瀟，侯顯良.基于16S rDNA測序檢測原發性膽汁性膽管炎患者腸道菌群的變化[J].中國現代醫生，2021，59（19）：139-143，193.

[5] ZHAO W，YU M? L，TAO? X L，et al.Analysis of the intestinal microbial community altered during rotavirus infection in suckling mice[J].Virol J，2021，18（1）：254-263.

[6] 郭苗苗，張佳慧.抗生素相關性腹瀉患兒腸道菌群變化與血清細胞因子的關系[J].中國微生態學雜志，2020，32（9）：1056-1059，1064.

[7] 王碩，張志華.抗生素相關性腹瀉病原菌的檢測方法[J].臨床薈萃，2020，35（4）：369-372.

[8] 馮愛民，楊惠俠.不同益生菌對抗生素相關性腹瀉肺炎新生兒腸道菌群及促炎因子的影響[J].中國微生態學雜志，2019，31（7）：808-811，815.

[9] 王帆，王娟，翁明瑤，等.功能性便秘幼兒腸道菌群的16S rDNA和REP-PCR檢測分析及效果評價[J].中國現代醫生，2019，57（18）：1-4，8，169.

[10] 張莉，窠文博，張穎，等.嬰幼兒抗生素相關性腹瀉的影響因素及其防治[J].中國微生態學雜志，2019，31（3）：320-322，328.

[11] 杜金龍，馮燕，李恒濤.實時熒光定量PCR結合探針檢測MP的臨床價值及MP耐藥情況分析[J].檢驗醫學，2020，35（6）：535-539.

[12] 臧曉明，景彩，肖寧，等.基于16S rDNA基因測序技術分析不同身體質量指數人群的腸道菌群結構差異[J].中華中醫藥雜志，2021，36（1）：451-455.

[13] 賀銳，張麗秀，葉萍，等.用16S rRNA熒光定量PCR技術分析低出生體重兒腸道菌群變化及影響因素[J].中國微生態學雜志，2017，29（7）：776-781.

（收稿日期：2023-05-11）