LINC01614對非小細胞肺癌A549細胞增殖、侵襲、細胞周期以及凋亡的影響

白鈺明 施琳 賈永峰 劉霞 陳永霞 云芬

肺癌是所有癌癥中發病率和死亡率最高的疾病,嚴重威脅著人類的健康[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占肺癌總數的85%,其組成主要為腺癌與鱗癌。盡管非小細胞肺癌的治療手段得到了改進,但其預后仍不理想,5年總體生存率較低[2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種長度大于200個堿基對(bp)的分子[3]。近年來,隨著研究的深入,lncRNA通過調節腫瘤發生發展的途徑,在腫瘤的增殖、侵襲及凋亡中發揮著重要作用[4]。研究表明LINC01614與肺癌的發生發展有一定的關系,但其生物學功能尚不明確[5]。本研究通過沉默非小細胞肺癌A549細胞的LINC01614基因,觀察LINC01614對非小細胞肺癌細胞增殖、侵襲、細胞周期及凋亡的影響,以期為NSCLC的診斷與治療提供新的靶向基因。

資料與方法

一、實驗材料

1 細胞株 人非小細胞肺癌細胞株A549購自北納生物科技有限公司;人支氣管上皮細胞株BEAS-2B購自上海百茂生物醫藥科技有限公司。該研究已通過內蒙古醫科大學附屬醫院倫理委員會批準[NO.WZ(2022034)]。

2 主要試劑 小干擾RNA LINC01614(si-LINC01614)、小干擾RNA Negataive Control(si-NC)購自蘇州吉瑪生物科技有限公司;胎牛血清、RPMI-1640培養基、青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶均購自美國Gibco有限公司;InRcute lncRNA qPCR試劑盒、InRcute lncRNA 第一鏈合成試劑盒、凋亡試劑盒(Annexin V-FITC/PI)、無酶水均購自北京天根生化科技有限公司;CCK試劑盒、TransZol Up、RNase A均購自北京全式金生物技術有限公司;細胞周期試劑盒、不含EDTA胰酶、2%結晶紫染色液均購自北京博奧森生物技術有限公司;4%多聚甲醛購自北京酷來搏科技有限公司;DPBS磷酸鹽緩沖液購自北京蘭潔柯科技有限公司;細胞培養基質膠購自美國Biozellen有限公司;LipofectamineTM 3000試劑購自美國invitrogen有限公司;PCR引物購自上海生工生物有限公司。

二、實驗方法

1 LINC01614在非小細胞肺癌中的表達與臨床病理特征及預后的相關分析 從TCGA(The Cancer Genome Atlas)數據庫中選取49例正常樣本及502例腫瘤樣本RNA轉錄組數據進行LINC01614單基因分析,分析LINC01614在人非小細胞肺癌組織和正常組織中的表達差異。同時選取504例非小細胞肺癌臨床數據,將LINC01614的表達與其臨床病理特征(性別、年齡、腫瘤分期、腫瘤大小、生存期等)進行相關性分析,P<0.05即差異有統計學意義。

2 細胞培養與轉染 BEAS-2B及A549細胞培養于含有1%青-鏈霉素、10%胎牛血清以及89%RPMI-1640的完全培養基中,置于37℃、含有5% CO2且具有一定濕度的細胞培養箱中。當細胞密度達80%～90%時,將A549細胞接種于六孔板中,接種數量以過夜后密度達50%～70%為宜,分別轉染si-LINC01614、si-NC,轉染完成后將細胞分為三組,即A549細胞組(對照組)、si-NC細胞組(陰性對照組)以及si-LINC01614細胞組(實驗組)。si-RNA序列(見表1)。

表1 siRNA名稱及序列

3 qRT-PCR檢測LINC01614在A549細胞與BEAS-2B的差異性表達以及檢測A549細胞中LINC01614的轉染效果 待細胞密度達到80%～90%,即可提取細胞中的RNA,具體操作步驟按TransZol Up試劑盒說明書進行。用核酸定量儀測定其純度和濃度,根據InRcute lncRNA 第一鏈合成試劑盒操作說明進行反轉錄合成cDNA。按照InRcute lncRNA qPCR試劑盒說明書進行操作,以cDNA作為模板進行PCR特異性擴增,反應條件為預變性:95 ℃ 3 min;變性:95 ℃ 5 s,退火和延伸:60 ℃ 15 s,40個循環。反應結束后觀察PCR溶解曲線及擴增曲線,記錄每個孔的CT值,采用2-ΔΔCt表示LINC01614的相對表達量,ΔCt=CtLINC01614-CtGAPDH,ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組,引物序列(見表2)。

表2 引物序列

4 CCK實驗檢測LINC01614的表達對細胞增殖的影響 將細胞按照1×103個/孔的密度接種于96孔板內部中,每孔加入RPMI-1640完全培養基100μL,置于37℃恒溫培養箱中培養12 h;于96孔板中每孔加入10μL的CCK試劑,37℃孵育3 h;用酶標儀測定450nm處吸光度(OD值),測定間隔為24 h,連續測量4次,實驗分為三組[A549細胞組(對照組)、si-NC細胞組(陰性對照組)和si-LINC01614細胞組(實驗組)],每組設置5個復孔,實驗重復3次。

5 長時間動態活細胞成像儀(IncuCyte S3)監測LINC01614對細胞融合率的影響 轉染12 h后,即可將細胞接種于96孔板中,每孔細胞密度控制在4×103個,待細胞貼壁后(約12 h)放入IncuCyte S3中,培養條件為37℃,5%CO2。設置拍照間隔時間為12 h,共拍攝48 h。拍攝完畢后根據系統記錄分析軟件所生成的數據繪制增殖曲線圖,橫坐標為時間,縱坐標為細胞融合百分比。

6 Transwell細胞侵襲實驗 本實驗使用Biozellen?3D細胞培養基質膠套裝進行配膠。待膠凝后,在Transwell上室分別加入0.1 mL的無血清的RPMI-1640細胞懸液(A549細胞、si-NC細胞以及si-LINC01614細胞),細胞密度為4.5×103個/孔;在Transwell下室中加入0.8 mL的含有10%血清的RPMI-1640細胞培養液。將24孔Transwell細胞培養板于37℃,5% CO2培養箱中孵育35 h,之后用結晶紫染色。將Transwell上室放至載玻片上,移至顯微鏡下,隨機5個視野觀察遷移的細胞數。

7 流式細胞術檢測細胞周期 轉染完成后48～72 h,使用胰酶收集A549細胞、si-NC細胞以及si-LINC01614細胞,1000rpm離心4 min,PBS洗滌2遍。每個樣品加入5 mL冰浴預冷的95%乙醇,混勻后4℃過夜(12～24 h)。1000rpm離心4 min,小心移除上清液。加入5 mL冰浴預冷的PBS,再次離心,為避免吸走細胞,可以殘留40 μL左右的PBS。按照每個樣品中加入4 μL的RNase A,15 μL碘化丙啶染色液,0.4 mL的染色緩沖液的配比,提前配制好適量染色液,注意配液及染色過程中全程避光。每管樣品中加入0.419 mL配好的碘化丙啶混合液,充分重懸細胞,37℃避光水浴30 min。使用Beckman流式細胞儀檢測并分析。

8 流式細胞術檢測細胞凋亡 轉染完成后48～72 h,333 g,4℃離心4 min,收集A549細胞、si-NC細胞以及si-LINC01614細胞。PBS清洗細胞2次,333 g,4℃離心4 min,收集細胞。用100 μL的1×Annexin V Binding Buffer重懸細胞,之后分別加入5 μL的Annexin V-FITC以及PI,混勻。23℃下避光反應15 min。于每個樣品中加入400 μL 1×Annexin V Binding Buffer,避光保存,1 h內應進行流式細胞儀檢測,上機時應輕彈管底,以保證細胞沉淀充分溶解。

三、統計學分析

結 果

一、LINC01614的表達與預后以及臨床特征相關性分析

1 LINC01614在非小細胞肺癌中的表達 對TCGA數據庫中的502例腫瘤樣本以及49例正常樣本進行分析,結果顯示,在正常和腫瘤樣本中LINC01614的表達具有統計學意義(P<0.05),與正常樣本相比,LINC01614在腫瘤樣本中的表達顯著增加(見圖1);為了探究非小細胞肺癌組織中LINC01614與正常組織間lncRNA的表達差異,LINC01614單基因配對差異分析(癌旁正常組織和癌組織在同一患者中的基因配對表達情況)顯示,在癌組織和癌旁組織中LINC01614的表達量具有顯著性差異(P<0.001),在癌組織中,LINC01614的表達更為顯著(見圖2)。

圖1 TCGA數據庫中LINC01614表達差異

圖2 TCGA數據庫中LINC01614單基因配對差異分析

2 LINC01614在TCGA數據庫中的生存分析 使用TCGA數據庫進行LINC01614單基因生存分析,運用R軟件中的survminer包和survival包對LINC01614低表達組和高表達組進行生存分析,結果顯示,與LINC01614低表達組相比,LINC01614高表達組的生存期未發生明顯變化(P=0.050,P≥0.05)(見圖3)。

圖3 TCGA數據庫中LINC01614的生存分析

3 LINC01614的表達與臨床特征的相關性分析 將臨床病理資料與LINC01614做相關性分析。結果顯示,LINC01614的表達與性別、年齡、腫瘤大小(tumor,T)以及淋巴結轉移(lymph node,N)均無相關性(P均>0.05),差異無統計學意義;LINC01614的表達與遠處轉移(metastasis,M)、腫瘤分期(stage)相關(P<0.05);LINC01614的表達在發生遠處轉移的患者中顯著升高;與腫瘤Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期患者相比,LINC01614的表達在Ⅳ期患者中顯著上升(見圖4)。

圖4 LINC01614的表達與性別、年齡、腫瘤大小、淋巴結轉移、遠處轉移以及分期的相關性分析

二、LINC01614在肺癌細胞以及人正常肺上皮細胞的表達

選取非小細胞肺癌A549細胞以及人正常肺上皮細胞BEAS-2B,進行qRT-PCR檢測LINC01614的表達。結果顯示,在兩種細胞間LINC01614的表達有統計學意義(t=7.545,P=0.033),與BEAS-2B細胞相比,LINC01614在A549細胞上的表達顯著上調(見圖5)。

圖5 BEAS-2B以及A549細胞中LINC01614的相對表達量,*P<0.05

三、qRT-PCR檢測LINC01614 siRNA基因沉默效果

對A549細胞組,si-NC細胞組以及si-LINC01614細胞組進行qRT-PCR檢測,結果顯示,與A549細胞組以及si-NC細胞組相比,si-LINC01614細胞組中LINC01614的表達具有差異(t=17.759,P<0.001;t=0.436,P=0.020),LINC01614在si-LINC01614細胞組中的表達均顯著低于其它兩組,表明LINC01614已被成功沉默(見圖6)。

圖6 qRT-PCR檢測LINC01614的相對表達量,*P<0.05

四、沉默LINC01614對肺癌細胞增殖的影響

A549細胞組、si-NC細胞組以及si-LINC01614細胞組的CCK實驗結果顯示,與A549細胞對照組以及si-NC細胞組比較,si-LINC01614細胞組的細胞增殖能力被顯著抑制(t=4.045,P=0.003;t=6.426,P=0.011);A549細胞組與si-NC細胞組相比,增殖能力無明顯差異(t=0.421,P=0.194)(見圖7)。

圖7 A549細胞的CCK增殖實驗,*P<0.05

五、IncuCyte S3對si-LINC01614、si-NC以及A549細胞組的生長監測

三組細胞接種于96孔板后,IncuCyte S3在12 h,24 h,36 h,48 h以及60 h的監測結果顯示,si-LINC01614細胞組的細胞密度減小,si-LINC01614細胞組的細胞融合率顯著低于A549細胞組以及si-NC細胞組(t=32.473,P<0.001;t=4.947,P<0.001),而si-NC細胞組與A549細胞組的增殖速度無明顯差異(t=4.634,P=0.107)(見圖8)。實驗結果表明,si-RNA所介導的LINC01614基因沉默可抑制A549細胞生長,減弱腫瘤的增殖能力。

圖8 A549細胞在IncuCyte中的增殖曲線,*P<0.05

六、沉默LINC01614對肺癌細胞侵襲能力的影響

分別將A549細胞組、si-NC細胞組以及si-LINC01614細胞組的肺癌細胞接種于Transwell上室中,37 h后計數穿過基質膠緊貼膜的細胞數。A549細胞組、si-NC細胞組以及si-LINC01614細胞組的穿膜細胞數分別為(431±25.23)個/HP、(386±32.69)個/HP、(209±5.37)個/HP;與A549細胞組以及si-NC細胞組相比,si-LINC01614細胞組的A549侵襲細胞數明顯減少(t=4.568,P<0.001;t=7.357,P<0.001),A549細胞組與si-NC細胞組相比,侵襲的細胞數無明顯差異(t=0.407,P=0.075)(見圖9)。以上實驗結果表示,沉默LINC01614基因使得肺癌A549細胞的侵襲能力減弱。

圖9 轉染si-LINC01614對A549細胞的侵襲能力影響(結晶紫染色,×20),染色細胞數越多表示細胞侵襲力越強,*P<0.05

七、沉默LINC01614對肺癌細胞周期的影響

流式細胞術細胞周期結果檢測顯示,A549細胞組、si-NC細胞組以及si-LINC01614細胞組的G0/G1期細胞比例分別為(60.79±2.43)%、(62.20±1.46)%、(68.95±5.88)%;三組細胞的S期的細胞比例分別為(17.80±0.97)%、(18.60±0.92)%、(6.76±0.77)%(見表3)。A549細胞組與si-NC細胞組相比,G0/G1期、S期的細胞比例均未發生明顯差異(t=1.034,P=0.256;t=0.101,P=0.173);與A549細胞組及si-NC細胞組相比,si-LINC01614細胞組G0/G1期的細胞比例增多(t=2.785,P<0.001;t=0.843,P<0.001);si-LINC01614細胞組S期的細胞比例顯著減少(t=1.829,P<0.001;t=1.120,P<0.001)(見圖10)。以上實驗結果表明,沉默LINC01614使得A549細胞的G0/G1期延長,S期縮短,細胞增殖受到抑制。

圖10 轉染si-LINC01614對A549細胞周期的影響

表3 A549、si-NC及si-LINC01614細胞組的G0/G1期、S期細胞占比

八、沉默LINC01614對肺癌細胞凋亡的影響

對si-NC細胞組和si-LINC01614細胞組的流式細胞術凋亡結果顯示,si-NC細胞組的凋亡率為(16.08±0.76)%,si-LINC01614細胞組的凋亡率為(11.95±1.33)%,兩組的細胞凋亡率有統計學意義(t=1.598,P<0.001),si-NC細胞組的凋亡率明顯高于si-LINC01614細胞組(見圖11)。實驗結果表明,沉默LINC01614可能對A549細胞的凋亡產生抵抗作用。

圖11 轉染si-LINC01614對A549細胞凋亡的影響

討 論

肺癌是世界上死亡率最高(21%)的腫瘤[1],但只有30%～40%的患者在腫瘤早期能夠被確診[6]。非小細胞肺癌約占肺癌患者總數的85%,而在大部分的非小細胞肺癌患者中,確診時疾病已進展至晚期,化療、靶向治療以及免疫治療是其主要治療手段[7]。近年來免疫抑制劑的出現改變了非小細胞肺癌的治療模式,通過有效的治療靶點可增強機體的抗腫瘤活性,從而改善患者預后。

lncRNA是哺乳動物轉錄組的主要成分,是調控細胞中多種機制的核心分子[8]。到目前為止,大多數lncRNA被發現在調節細胞周期、增殖和凋亡等確保體內平衡的細胞機制中起著至關重要的作用。由于其在基因組中的位置和分布,lncRNA通過轉錄和轉錄后加工直接或間接地影響一系列蛋白質的轉錄,從而以一種“承上啟下”的方式打開了“lncRNA-癌癥模式”,即促進或抑制腫瘤發展。lncRNA在調節典型癌癥特征方面的作用呈多樣性,如持續增殖、凋亡抗性、基因組的不穩定性、抗藥性、侵襲和轉移[9]。近年來,在應用lncRNA作為潛在的治療靶點方面進行了大量的研究,這為未來的癌癥治療帶來了巨大的希望。

LINC01614是一種新發現的lncRNA,其在腫瘤上的研究尚處于起步階段。研究發現[10],LINC01614通過miR-520a-3p/SNX3軸促進骨肉瘤進展,LINC01614基因的敲除能夠顯著抑制骨肉瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。此外,LINC01614還可促進膀胱癌的發生發展,Wang Z等[11]發現LINC01614可通過miR-217/RUNX2/Wnt/β-Catenin軸促進膀胱癌的增殖、遷移和侵襲。LINC01614還可以作為預測乳腺癌預后的生物標志物[12]。LINC01614在肺癌中的研究也取得了一定進展,LINC01614可以通過抑制miR-217的表達來促進Foxp1的表達,從而促進肺癌的發展,但其對肺癌細胞周期以及侵襲力的影響尚未探究[5]。

為了研究LINC01614對非小細胞肺癌的增殖、侵襲、細胞周期及凋亡的影響,本課題首先通過生物信息學方法分析TCGA庫中LINC01614在非小細胞肺癌中的表達,結果顯示,非小細胞肺癌中LINC01614的表達量顯著高于癌旁正常組織。Sun Y等[13]通過生物信息學手段研究出LINC01614在肺癌中存在差異性表達,與上述研究結果一致。然后采用qRT-PCR方法檢測出在細胞水平上LINC01614的差異性表達,LINC01614在非小細胞肺癌A549細胞上的表達量顯著高于人正常肺上皮細胞BEAS-2B,與非小細胞肺癌組織上預測的結果相一致,提示LINC01614表達增加可能與NSCLC的發生、發展相關。之后利用si-RNA介導的脂質體轉染法去沉默LINC01614在非小細胞肺癌A549細胞上的表達,同時驗證了轉染效率。隨后利用CCK增殖實驗,同時輔以IncuCyte S3監測細胞的生長狀態及融合情況,結果顯示,沉默LINC01614可抑制A549細胞的增殖能力。然后采用Transwell細胞侵襲實驗檢測細胞的侵襲能力,結果顯示,沉默LINC01614基因可以抑制A549細胞的侵襲能力。之后采用流式細胞術PI單染法檢測細胞周期,結果顯示沉默LINC01614可使A549細胞的G0/G1期延長,S期縮短,上述結果提示LINC01614的高表達與非小細胞肺癌的發生、發展及侵襲轉移等惡性生物學行為有顯著的相關性。最后利用Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡,結果表示沉默LINC01614后,A549細胞的凋亡率下降,LINC01614可能增強了A549細胞抵抗凋亡的能力。目前研究表明[5],LINC01614對肺腺癌NCI-H1395和NCI1975細胞的凋亡起抑制作用。而本實驗研究結果表明,沉默LINC01614后,對肺癌A549細胞的凋亡起抑制作用,究其原因,可能為所選擇細胞系不同而造成的差異,也可能為轉染效率的差異所導致;此外,在生物學中,增殖和凋亡一般被認為是兩種對立的概念,然而隨著研究的不斷深入,研究者發現了通過Caspase3介導,可使凋亡的細胞刺激現有存活的腫瘤細胞,從而導致腫瘤的再增殖[14]。Yang J等[15]發現,LINC01614的敲除可以抑制H9c2心肌細胞的凋亡,對于LINC01614對非小細胞肺癌凋亡能力的影響,仍需進一步研究,以探求其具體機制。

綜上所述,本研究在組織水平利用生物信息學方法研究出LINC01614在NSCLC上高表達,同時在細胞水平進行了驗證。LINC01614對A549細胞的增殖、侵襲以及凋亡均起促進作用,沉默LINC01614后,A549細胞的G0/G1期延長,S期縮短,但其在調控非小細胞肺癌上的具體機制仍需進一步研究,LINC01614有望成為NSCLC潛在的診斷標志物和治療靶點。