蒼術素調節Notch信號對EGFR-TKI耐藥的非小細胞肺癌細胞株H1975增殖、凋亡的影響

張琳 朱琳 李晨

肺癌仍是全世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占大多數[1]。雖然在過去的十年中,NSCLC在篩查、診斷和治療方面均取得了顯著進展,但由于NSCLC早期癥狀不典型,多數患者確診時已處于疾病晚期,無法進行手術治療,導致患者生存時間仍較短[2-3]。另外,隨著表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI)的上市,盡管EGFR突變的晚期NSCLC患者治療療效有所提高,但耐藥成為了EGFR-TKI治療的瓶頸,絕大部分患者經一線治療后數月即出現疾病進展[4-5]。因此,開發新的治療藥物以降低EGFR-TKI耐藥性是NSCLC患者有效治療的關鍵,也是目前NSCLC治療的熱點和難點問題。近年來,天然中草藥因其高效、低毒等優勢而在各個研發領域廣受歡迎。蒼術素作為茅蒼術根莖所含精油中的一種活性成分,其抗肺纖維化[6]、抗炎[7]、抗癌[8]等作用已被報道。然而,蒼術素對EGFR-TKI耐藥NSCLC的作用及分子機制尚不明確。此外,已有研究表明在EGFR-TKI治療下EGFR突變肺腺癌的Notch改變可導致組織學小細胞癌轉化[9];在EGFR-TKI治療后,一半EGFR突變的NSCLC腫瘤組織中Notch1和HES1上調,且Notch抑制劑可削弱體外和體內奧希替尼(三代EGFR-TKI)耐藥性,并表明Notch抑制劑和奧希替尼聯合可能是EGFR突變NSCLC的潛在治療方法[10]。基于此,本研究以人肺腺癌細胞H1975為研究對象,探討蒼術素對EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞增殖、凋亡的影響以及Notch信號通路在此過程中的作用。

資料與方法

一、主要材料

1 實驗細胞 人NSCLC細胞系H1975細胞(人肺腺癌細胞,ATCC-172)、人正常肺上皮細胞BEAS-2B(ATCC-539)來源于美國ATCC公司。將H1975細胞重懸于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的RPMI-1640培養基中,置于37℃,5% CO2培養箱中培養,待細胞融合度達到80%左右時進行消化傳代,2～3 d換液一次,取對數生長期細胞進行后續實驗。

2 主要試劑 蒼術素(純度:HPLC≥98%,B20128-20 mg)購自上海源葉生物科技有限公司;Notch抑制劑1(一種Notch抑制劑,純度99.81%,HY-12860)購自美國MCE公司;MTT試劑(FS-RT2568)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(FS-E9680)購自上海撫生實業有限公司;膜聯蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)雙染細胞凋亡檢測試劑盒(FY600003-20T)購自上海弗元生物科技有限公司;cDNA鏈合成試劑盒(XY-PCR-1590)購自上海烜雅生物科技有限公司;TRIzol試劑(LM-0010)、熒光定量PCR MasterMix(SYBR Green)(LM-0017)、RIPA裂解液(LM801001C)購自上海酶聯生物工程有限公司;ECL發光試劑(WBKlS0100)購自美國Millipore公司;兔源一抗Notch1(ab52627,1∶1 000)、Notch3(ab23426,1∶1 000)、Hes1(ab71559,1∶1 000)、HEY1(ab154077,1∶1 000)、β-actin(ab8227,1∶1 000)和二抗HRP標記羊抗兔IgG(ab205718,1∶3 000)購自英國Abcam公司。

二、實驗方法

1 EGFR-TKI耐藥細胞株構建 以人肺腺癌細胞H1975為親本細胞,采用低濃度逐步加量誘導法構建EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/吉非替尼耐藥(gefitinib resisitant,GR)[11],具體操作為:將處于對數生長期且生長狀態良好的親本細胞H1975接種于24孔板中,第1 d添加0.5 μmol/L吉非替尼,第2 d添加1.0 μmol/L吉非替尼,第3 d添加1.5 μmol/L吉非替尼,第4 d添加2.0 μmol/L吉非替尼,以后每天均添加2.0 μmol/L吉非替尼進行培養,直到添加吉非替尼后細胞不會出現死亡為止,此時說明EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR構建成功。

2 MTT法檢測親本細胞H1975和耐藥細胞H1975/GR對吉非替尼的敏感性以及蒼術素對H1975、H1975/GR細胞的毒副作用 將處于對數生長期的H1975和H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后添加不同濃度吉非替尼(終濃度為0、0.1、0.5、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L),其中0 μmol/L吉非替尼處理組為對照組,在37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續培養2 h后使用酶標儀檢測各孔在490 nm波長處的吸光度值(OD490 nm),計算細胞存活率以及吉非替尼抑制細胞增殖的半數抑制濃度(IC50)。細胞存活率(%)=實驗組OD490 nm/對照組OD490 nm×100%。

將處于對數生長期的BEAS-2B、H1975和H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后添加不同濃度蒼術素(終濃度為0、10、20、40、60、80 μmol/L)[12],其中0 μmol/L蒼術素處理組為對照組,常規培養48 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續培養2 h后使用酶標儀檢測各孔的OD490 nm,計算細胞存活率。

3 細胞分組與藥物干預 H1975/GR細胞分為正常組、蒼術素(低、中、高)濃度組、Notch抑制劑組。其中,正常組細胞不添加任何藥物;蒼術素(低、中、高)濃度組細胞分別添加終濃度為20、40、60 μmol/L的蒼術素;Notch抑制劑組細胞添加終濃度為7.8 nmol/L的Notch抑制劑1[13]。

4 MTT法檢測各組H1975/GR細胞增殖活力 H1975/GR細胞以每孔5000個細胞接種于96孔板中(每孔100 μL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中分組與處理方法進行干預,常規培養24 h、48 h、72 h后每孔添加20 μL MTT溶液(5 mg/mL),繼續培養2 h后使用酶標儀檢測各孔的OD490 nm,并以OD490 nm表示細胞增殖活力。

5 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞周期分布 H1975/GR細胞以每孔5×105個接種到6孔板中(每孔2 mL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中方法干預,常規培養48 h收集細胞,并將細胞重懸于PBS溶液中,計數1×106個細胞,添加500 μL PI染色液室溫避光染色20 min,使用流式細胞儀自帶軟件分析細胞周期。

6 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞凋亡率 H1975/GR細胞以每孔5×105個接種到6孔板中(每孔2 mL),待細胞貼壁后按照實驗方法3中方法干預,常規培養48 h收集細胞,PBS洗滌后加入Annexin V-FITC結合液重懸細胞,隨后加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL PI染色液室溫避光染色15 min,使用流式細胞儀自帶軟件分析細胞凋亡率。

7 qRT-PCR檢測各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關基因表達水平 收集按照實驗方法3中方法干預48 h后的各組H1975/GR細胞,TRIzol試劑提取細胞中總RNA,并按cDNA鏈合成試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA,隨后以cDNA為模板,將其與基因特異性引物(引物由上海吉瑪制藥技術有限公司設計并合成,引物序列見表1)和熒光定量PCR MasterMix(SYBR Green)等試劑相混合配制qRT-PCR反應體系,最后置于qRT-PCR儀上擴增。以GAPDH為內參,采用2-ΔΔCt法定量分析細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平。

表1 引物序列信息

8 Western Blot檢測各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關蛋白表達水平 收集按照實驗方法3中方法干預48 h后的各組H1975/GR細胞,使用RIPA裂解液充分裂解提取細胞中總蛋白,BCA法測定蛋白濃度并加熱煮沸使蛋白變性。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白,并在切膠后將蛋白轉移至PVDF膜,5% BSA室溫封閉膜1 h,隨后加入一抗(Notch1、Notch3、Hes1、HEY1、β-actin抗體)4℃冰箱中孵育過夜,PBST洗滌后加入二抗(HRP標記羊抗兔IgG)37℃培養箱中孵育45 min,ECL發光試劑顯色。以β-actin為內參,Image J軟件半定量分析蛋白條帶灰度。

三、統計學方法

結 果

一、親本細胞H1975和耐藥細胞H1975/GR對吉非替尼的敏感性

與0 μmol/L吉非替尼比較,(2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L)吉非替尼均可顯著降低H1975細胞存活率(P均<0.05),而(10.0、15.0、20.0、25.0、30.0 μmol/L)吉非替尼可顯著降低H1975/GR細胞存活率(P均<0.05)(見表2)。經計算,吉非替尼抑制H1975/GR細胞的IC50為(24.84±2.37)μmol/L,顯著高于抑制H1975細胞的IC50[(13.05±1.86)μmol/L](t=9.586,P<0.05)。表明本研究所構建的EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR可以用于后續實驗。

表2 不同濃度吉非替尼干預后H1975和H1975/GR細胞存活率比較

與0 μmol/L蒼術素比較,80 μmol/L蒼術素可顯著降低BEAS-2B細胞存活率(t=9.048,P<0.001),而(20、40、60、80 μmol/L)蒼術素均可顯著降低H1975、H1975/GR細胞存活率(tH1975細胞=8.828、15.967、22.195、28.151,tH1975/GR細胞=6.850、13.230、19.155、24.666,均P<0.001),且60、80 μmol/L蒼術素干預下,H1975/GR細胞存活率顯著高于H1975細胞(t=2.661、3.368,P=0.024、0.007)(見表3)。因此,選用20、40、60 μmol/L蒼術素作為低、中、高濃度進行下一步實驗。

表3 不同濃度蒼術素干預后BEAS-2B、H1975和H1975/GR細胞存活率比較

二、各組H1975/GR細胞增殖活力比較

藥物干預24 h后,與正常組比較,蒼術素(中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05);與蒼術素低濃度組比較,蒼術素高濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05)。藥物干預48 h、72 h后,與正常組比較,蒼術素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05),且蒼術素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞增殖活力降低(P均<0.05)(見表4)。

表4 各組H1975/GR細胞增殖活力比較

三、各組H1975/GR細胞周期分布比較

與正常組比較,蒼術素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例降低(P均<0.05),G2/M細胞比例升高(P均<0.05),且蒼術素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例降低(P均<0.05),G2/M細胞比例升高(P均<0.05);與蒼術素高濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中G2/M細胞比例降低(P<0.05)(見圖1和表5)。

圖1 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞周期分布情況 A為正常組;B為蒼術素低濃度組;C為蒼術素中濃度組;D為蒼術素高濃度組;E為Notch抑制劑組

表5 各組H1975/GR細胞周期分布比較

四、各組H1975/GR細胞凋亡率比較

與正常組比較,蒼術素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞凋亡率升高(P均<0.05),且蒼術素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞凋亡率升高(P<0.05)(見圖2和表6)。

圖2 流式細胞儀檢測各組H1975/GR細胞凋亡情況 A為正常組;B為蒼術素低濃度組;C為蒼術素中濃度組;D為蒼術素高濃度組;E為Notch抑制劑組

表6 各組H1975/GR細胞凋亡率比較

五、各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關基因表達水平比較

與正常組比較,蒼術素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平降低(P均<0.05),且蒼術素各濃度組呈濃度依賴性(P均<0.05);與蒼術素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平降低(P<0.05)(見表7)。

表7 各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA表達水平比較

六、各組H1975/GR細胞中Notch信號通路相關蛋白表達水平比較

與正常組比較,蒼術素(低、中、高)濃度組和Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平降低(P<0.05),且蒼術素各濃度組呈濃度依賴性(P<0.05);與蒼術素(低、中)濃度組比較,Notch抑制劑組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平降低(P<0.05)(見圖3和表8)。

圖3 Western Blot檢測各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達 泳道1為正常組;泳道2為蒼術素低濃度組;泳道3為蒼術素中濃度組;泳道4為蒼術素高濃度組;泳道5為Notch抑制劑組

表8 各組H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1蛋白表達水平比較

討 論

EGFR-TKI靶向治療是晚期EGFR突變NSCLC患者一線治療的標準方式,可顯著改善患者預后,延長無進展生存期[14]。但使用EGFR-TKI治療期間不可避免地會出現耐藥性,獲得性耐藥已成為導致NSCLC患者治療失敗的重要原因,且這對患者和臨床醫生來說目前仍是一個重大挑戰[15]。因此,進一步闡明EGFR-TKI治療NSCLC的耐藥機制,并尋找新藥物靶點和開發新藥物成為臨床中急需解決的問題。

研究表明,蒼術素作為一種天然中草藥,具有抗腫瘤、抗炎等多種藥理活性[16-17]。蒼術素對肺癌細胞A549、NCI-H23、NCI-H460、HCC827的增殖均具有抑制作用,尤其A549細胞,并可誘導A549細胞凋亡和抑制細胞遷移[18]。然而,蒼術素在EGFR-TKI耐藥NSCLC中的作用尚有待探索。吉非替尼是第一代EGFR-TKI的一線治療藥物[19],本研究通過低濃度逐步加量誘導法構建EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR,結果顯示H1975/GR細胞對吉非替尼的IC50顯著高于H1975細胞對吉非替尼的IC50,表明本研究所構建的EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR可以用于后續實驗。此外,本研究發現(20、40、60 μmol/L)蒼術素均可顯著降低H1975、H1975/GR細胞存活率,但對BEAS-2B細胞存活率無顯著影響,故選用20、40、60 μmol/L蒼術素作為低、中、高濃度進行下一步實驗。進一步分析顯示,低、中、高濃度蒼術素均可降低H1975/GR細胞增殖活力,且呈濃度依賴性。表明蒼術素可抑制EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR增殖。此外,靶向調節細胞周期,從而誘導細胞周期阻滯是抑制腫瘤細胞增殖的主要特征之一,也是一種重要的抗腫瘤機制[20]。本研究結果顯示,蒼術素可呈濃度依賴性降低H1975/GR細胞中G0/G1細胞比例,并升高G2/M細胞比例。提示蒼術素可能通過誘導EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR G2/M期阻滯,進而抑制細胞增殖。細胞凋亡亦可影響細胞生長、分化等生理過程,與癌癥等病理過程密切相關,且近三十多年來,臨床腫瘤學的支柱和目標一直是開發通過促進細胞凋亡而有效消除癌細胞的療法[21]。本研究中,蒼術素可呈濃度依賴性升高H1975/GR細胞凋亡率,表明蒼術素可能是通過促進EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR凋亡而殺死癌細胞的潛在藥物。

Notch信號通路是一條進化上十分保守的信號轉導途徑,Notch受體(包括Notch1、Notch2、Notch3和Notch4)通過與配體相互作用激活Hes、HEY等堿性-螺旋-環-螺旋轉錄抑制因子家族的靶基因,從而轉導細胞信號調控細胞增殖、分化和凋亡等生物學過程,且Notch信號通路的異常激活與肝癌[22]、肺癌[23]等腫瘤的發生發展密切相關。研究表明,Notch信號通路與肺腺癌化療耐藥有關,且Notch1可促進NSCLC細胞的吉非替尼耐藥[24]。Notch3在肺腺癌組織和EGFR-TKI耐藥細胞系(HCC827/GR6)中表達上調,且Notch3蛋白高表達的患者與較短的總生存期相關[25]。本研究結果顯示,蒼術素可呈濃度依賴性降低H1975/GR細胞中Notch1、Notch3、Hes1、HEY1 mRNA和蛋白表達水平,表明蒼術素可能通過抑制Notch信號通路激活調控EGFR-TKI耐藥細胞株H1975/GR增殖、細胞周期和凋亡。為了進一步驗證Notch信號通路的作用,本研究使用Notch抑制劑干預H1975/GR細胞,結果顯示Notch抑制劑既可抑制Notch信號通路激活,又能夠降低H1975/GR細胞增殖活力和G0/G1細胞比例,并升高G2/M細胞比例和凋亡率,且其作用效果與高濃度蒼術素幾乎相當。這進一步表明Notch信號通路可能參與蒼術素調控EGFR-TKI耐藥細胞增殖、細胞周期和凋亡的過程。

綜上所述,蒼術素可抑制EGFR-TKI耐藥的NSCLC細胞株H1975增殖,并誘導細胞周期阻滯和凋亡,其作用機制可能與抑制Notch信號通路激活有關。本研究為蒼術素在EGFR-TKI耐藥NSCLC治療中的應用提供了一定實驗依據。