川芎嗪對脂多糖誘導的小鼠ALI血管通透性的影響及相關分子機制研究

劉小碣 薛蕾 閔思敏 高可飛 陶偉婷 李言 張永,2

急性肺損傷 (acute lung injury,ALI)是導致機體出現以低氧血癥和呼吸窘迫為主要表現的臨床綜合征,炎癥反應等致病因素導致的血管內皮功能障礙及血管通透性增加是ALI的發病機制之一[1-2],而細胞骨架的改變影響內皮細胞形態和功能[3]。川芎嗪(tetramethylpyrazine,TMP)是從中藥川芎中提取得到的生物活性堿,具有改善微循環的作用,可能影響ALI發病中血管內皮功能[4-5]。mTOR (mammalian target of rapamycin) 是一種絲/蘇氨酸激酶,可調節細胞代謝[6],mTOR對GTP酶家族蛋白RhoA有調節作用[7],RhoA作為分子開關與細胞因子結合并通過ROCK信號級聯調節細胞骨架從而影響細胞的形態[8]。本研究將通過觀察TMP對小鼠肺血管內皮通透性的影響并探討其中參與調節細胞骨架功能信號通路的作用機制,為ALI臨床治療提供理論參考依據。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物來源

選擇SPF級6～8周齡雄性C57BL/6小鼠,飼養于蚌埠醫學院心腦血管疾病基礎與臨床重點實驗室的動物房內。動物房內全天溫度保持在21℃～25℃之間;空氣濕度為40%～70%;保持良好的通風;日間光照強度為100 Lux,光照周期為12小時光照,12小時黑暗。本研究遵循動物倫理要求[倫動科批字[2016]第015號]。

2 實驗器材

低溫高速離心機:美國 BECKMAN COULTER 公司;多功能酶標儀:PerkinElmer 公司;電子天平:美國 Mettler Toledo 公司;蔡司熒光倒置顯微鏡(德國 ZEISS公司);普通倒置相差顯微鏡:日本奧林巴斯公司;電熱鼓風干燥箱:上海一恒科學儀器有限公司;Western Blot 凝膠成像儀:上海天能生命科學有限公司。

3 藥品與試劑

脂多糖(lipopo1ysaccharide,LPS):美國 Sigma 公司;磷酸川芎嗪:中國藥品生物制品鑒定所;無水乙醇、二甲苯購自武漢賽維爾生物科技有限公司;4%多聚甲醛購自上海碧云天生物技術有限公司;RIPA 裂解液:上海碧云天生物技術有限公司;phosSTOP 磷酸酶抑制劑:瑞士 Roche 公司;PMSF:上海碧云天生物技術有限公司;Tris 粉、SDS 粉、甘氨酸粉:Bioforxx 公司兔抗人 Phospho-mTOR (Ser2448)抗體:美國 CST 公司;兔抗人RhoA抗體(ab187027):美國艾博抗公司。

二、方法

1 C57BL/6小鼠肺損傷模型的建立

選擇6-8周齡25g左右小鼠 50只,實驗分五組:溶劑對照組(CON組,n=10)、ALI模型組(ALI組,n=10)、川芎嗪低濃度治療組(TMP-L組,n=10)、川芎嗪中濃度治療組(TMP-M組,n=10)、川芎嗪高濃度治療組(TMP-H組,n=10)。川芎嗪低、中、高濃度組分別注射川芎嗪的量為50 mg/kg、100 mg/kg、150 mg/kg(生理鹽水稀釋)。ALI模型建立方法采用二次打擊法[9]:其中川芎嗪治療組在首次打擊前30 min腹腔注射川芎嗪,第一次打擊:向小鼠腹腔內注射2 mg/kg脂多糖(濃度2 mg/mL)。第一次打擊結束后12 h進行第二次打擊:向小鼠氣管內滴注4 mg/kg脂多糖(濃度4 mg/mL)。溶劑對照組用生理鹽水替代脂多糖進行打擊(注射量和滴注量同前)。川芎嗪治療組在二次打擊30 min后再次腹腔注射相同劑量川芎嗪。造模24 h后將小鼠頸椎脫臼處死并進行相應的取材。

2 小鼠肺組織病理學檢查

小鼠處死后打開胸腔剝離肺組織,置于濃度為10%的甲醛中浸泡固定24 h,然后轉至75%的酒精中,依次進行脫水、浸蠟、包埋處理,6 μm切片并脫蠟后進行常規蘇木精-伊紅(HE)染色并在蔡司顯微鏡下進行肺組織病理學觀察。

3 Western Blot檢測小鼠肺組織中P-mTOR蛋白和RhoA蛋白表達水平

取各處理組小鼠肺組織于研磨管中,以1:10的比例加入RIPA裂解液混合物,勻漿后離心,取上清蛋白進行電泳分離,轉膜,封閉后,將載有目的蛋白的膜放入分別裝有P-mTOR(1∶1 000)、RhoA(1∶2 000)、GAPDH(1∶10 000)的抗體中4℃孵育過夜,用Tris-HCl緩沖鹽吐溫溶液(TBST)洗膜3次,將膜放入辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶20 000)中室溫孵育2 h,TBST再次洗滌3次,曝光機曝光條帶后,使用ImageJ-v1.8.0軟件進行灰度值分析。

4 小鼠肺組織濕干重比值

每組取4只小鼠,處死后取出肺組織,用紙巾吸干肺表面的水分后進行稱量即為肺組織的濕重(W1),將肺組織放入鼓風干燥箱中60℃烘干48 h至恒重此即為肺組織干重(D1),計算肺組織濕干重比值W/D=W1/D1×100%。

5 小鼠BALF白細胞計數和總蛋白濃度的測定

每組取4只鼠,處死后仰臥于操作臺上,固定四肢,從喉部對小鼠行氣管切開術并插入氣管導管,分3次向肺內注入無菌生理鹽水,每次注入0.8 mL,回收肺泡灌洗液,回收率在70%～85%之間,1200 rpm離心10 min,上清用于測蛋白濃度,沉淀加入200 μL紅細胞裂解液重懸,后離心棄上清,1 mL PBS重懸沉淀用于細胞計數。測蛋白濃度時吸出樣本20 μL加入200 μL BCA溶液,60℃水浴35 min,測OD值并計算蛋白濃度。

6 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α水平

將上面步驟離心后的肺泡灌洗液上清用于檢測IL-1β、TNF-α促炎因子的表達量,根據試劑盒說明書步驟進行實驗。

7 Evans Blue染色測肺組織通透性

每組取4只小鼠,尾靜脈注射Evans Blue溶液(20 mg/kg),一小時后處死,通過心臟將肺血管中的血液沖洗干凈,取出肺組織稱重后以1:10的比例加入甲酰胺溶液,研磨后置于45℃水浴鍋中加熱72 h,加熱后2 000 rpm離心10 min,去沉淀留上清用酶標儀測溶液吸光度(λ=620 nm),根據標準曲線算出伊文思藍含量。

8 電子顯微鏡觀察血管內皮細胞緊密連接

每組取3只小鼠處死后快速取肺組織切塊,固定、脫水、制片、染色后置于電子顯微鏡下觀察肺微血管內皮細胞處緊密連接結構。

三、統計學分析

結 果

一、低、中、高濃度川芎嗪對ALI模型小鼠肺組織病理的影響

酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測結果顯示ALI模型組小鼠相比較對照組小鼠肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α 的表達量升高;在經川芎嗪中濃度(100 mg/kg)治療后,肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-α 的表達量明顯降低(見圖1)。與對照組比較,ALI模型組小鼠肺組織可見明顯炎性細胞浸潤及肺泡間隔明顯變寬,肺泡間隔及肺間質內有大量炎性細胞浸潤,提示造模成功;與模型組比較,中濃度川芎嗪治療組肺組織病變明顯改善,炎性細胞浸潤明顯減輕,細胞壞死脫落數量明顯減少,肺組織細胞結構明顯恢復,低、高濃度的川芎嗪對急性肺損傷緩解效果類似但不顯著(見圖2)。以上兩個實驗均證明川芎嗪中濃度(100 mg/kg)組治療效果最為顯著,后續探討川芎嗪對肺血管通透性的保護作用相關實驗均選擇中濃度川芎嗪進行研究。

圖1 肺泡灌洗液中IL-1β、TNF-ɑ 水平

圖2 小鼠肺組織病理學檢查結果(HE×200)

二、川芎嗪對肺血管通透性的影響

ALI模型組肺泡灌洗液中比對照組肺泡灌洗液中白細胞數和總蛋白濃度上升,川芎嗪治療組對比ALI模型組肺泡灌洗液中白細胞計數和蛋白濃度都下降(見圖3,4)。川芎嗪藥物治療可顯著降低急性肺損傷肺組織濕干比(見圖5)。在伊文思藍實驗中,伊文思藍可以與白蛋白結合,當肺血管滲透性增加時伊文思藍可以隨著白蛋白的滲出而滲出到肺間質,川芎嗪治療可以明顯降低伊文思藍的滲出(見圖6,7)。以上結果均提示川芎嗪可以改善急性肺損傷的血管滲漏作用。

圖3 小鼠肺泡灌洗液白細胞計數

圖4 小鼠肺泡灌洗液總蛋白濃度測定

圖5 各組小鼠肺組織濕干比

圖6 小鼠肺組織藍染后大體標本

圖7 肺組織Evans Blue 濃度值測定

三、川芎嗪干預對ALI小鼠肺組織中mTOR/RhoA信號通路的影響

Western Blot檢測P-mTOR、RhoA蛋白表達水平,P-mTOR是mTOR的活性形式,P-mTOR蛋白表達量的增加提示mTOR/RhoA通路被激活。WB實驗結果表明川芎嗪可以降低P-mTOR的表達量(見圖8)從而降低RhoA蛋白的表達水平(見圖9)。所以川芎嗪可以通過影響mTOR/RhoA信號通路改變細胞骨架,減輕肺血管通透性。

圖8 各組小鼠肺組織中P-mTOR表達水平

圖9 各組小鼠肺組織中RhoA表達水平

四、川芎嗪可改善肺血管內皮間緊密連接

上述結果均表明川芎嗪可以降低肺血管通透性,通過電鏡可觀察到LPS可使血管內皮細胞連接斷裂受損,血管內皮細胞的連接斷裂可造成血管通透性增加,川芎嗪治療后可改善被損傷的血管內細胞連接,從而降低血管通透性(見圖10)。

圖10 電鏡下小鼠肺血管內皮細胞緊密連接結構(×10 000)

討 論

急性肺損傷(ALI)曾被認為是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)早期階段(臨床上稱為ARDS),是發病率、死亡率很高的呼吸窘迫為特征的急性進展的呼吸衰竭[10]。它的病理特點是頑固的低氧血癥、雙側肺彌漫性浸潤、肺水腫、肺順應性下降和功能殘氣量下降[11]。在 ALI的病理過程中,肺血管內皮細胞是最先暴露于病理刺激的細胞,肺血管內皮細胞在肺組織發育、肺組織免疫以及維持肺血管張力和屏障完整性中起關鍵作用。肺血管內皮損傷、肺泡-毛細血管屏障通透性增加導致蛋白質和富含炎性細胞的液體流入肺泡腔、肺泡-毛細血管屏障之間的氣體交換減弱和炎癥失調是ALI發生和進展的關鍵環節[12]。本研究通過脂多糖“二次打擊”建立ALI模型,“二次打擊”模式與臨床環境相關,在第一次打擊引發初次炎癥后,患者在適當的時候更容易受到二次打擊的影響,故此模型可以更加有效的反映潛在的臨床情況,對臨床研究更有價值[13]。內皮細胞以TLR 4依賴的方式對LPS作出反應,導致促炎因子的釋放和粘附分子表達的增強[14]。據研究表明,LPS可以影響急性肺損傷的多個過程,引起多種促炎因子釋放,如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8等[15],其中,TNF-α和IL-1β可以誘導內皮細胞的細胞骨架重塑,增加肺血管通透性[16]。本研究中ELISA實驗結果顯示,脂多糖“二次打擊”可以明顯引起肺部炎癥反應,川芎嗪對急性肺損傷有治療效果,其中中濃度(100 mg/kg)川芎嗪可以明顯降低脂多糖引起的肺部炎癥因子升高和炎性細胞浸潤,此結果與肺組織病理切片結果相一致。而高濃度(150 mg/kg)川芎嗪治療效果較差,這可能與過高濃度的藥物腹腔注射對小鼠肝腎功能損害有關,機體代謝受到影響從而影響川芎嗪對肺部炎癥治療效果。由此結果我們確定了后續實驗的川芎嗪最佳給藥濃度。目前臨床上對于急性肺損傷的治療還沒有確切的治療方案,主要以原發病治療和呼吸支持治療為主要手段[17]。

哺乳動物雷帕霉素抑制靶點(mTOR)是下游的絲蘇氨酸激酶,存在于兩種復合體(mTORC1、mTORC2)中[18],這兩種復合體在功能和底物特異性上不同,mTORC1調節細胞生長和增殖,mTORC2通過RhoA/Rac1調節肌動蛋白細胞骨架和細胞運動[19]。有研究表明,抑制mTORC1(Raptor)和mTORC2 (Rictor)通過減少肌動蛋白細胞骨架的重塑和減少小GTP酶RhoA和Rac1的激活來抑制細胞的遷移和結直腸癌的進展[7]。另一項研究表明雷帕霉素可以通過mTORC1介導的S6K1和4E-BP1信號通路下調RhoA活性來抑制細胞骨架重組和細胞遷移[20],此外mTOR和RhoA的激活是1-磷酸神經酰胺刺激巨噬細胞增殖的重要機制的[21]。由于內皮緊密連接的屏障作用,毛細血管對血漿蛋白的通透性通常很低,炎性介質通過刺激內皮細胞收縮和內皮間隙的形成來增加內皮通透性,由此導致細胞旁通透性增加使富含蛋白質的水腫滲入間質,這是急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)等多種病理狀況的潛在原因[22]。RhoA GTP酶作為分子開關可以對細胞外信號做出響應,誘導肌動蛋白細胞骨架的組織和基因轉錄的協同變化,以驅動多種生物反應,包括形態發生、趨化性、軸突導向和細胞周期進程[8]。Rho GTP 酶通過其對肌動蛋白細胞骨架組織和內皮間連接完整性的作用參與調節內皮細胞通透性,在細胞培養研究中,RhoA 的激活會導致肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的抑制,隨后是肌球蛋白輕鏈(MLC)磷酸化的增加和肌動蛋白應力纖維的形成引起內皮間連接破壞并增加內皮通透性[23],從而引起血管滲漏。對于細胞骨架的研究涉及的比較多的是 Rac1/PAK/LIMK1/Cofilin以及RhoA/ROCK/LIMK1/cofilin兩大信號通路,mTOR作為兩大信號通路的上游蛋白,可能對細胞骨架重排引起的肺血管滲漏起著重要作用。EB(Evans Blue)是一種深藍色的染料,入血后迅速地與白蛋白結合,在內皮屏障損傷的情況下白蛋白會透過內皮屏障,所以我們用能與白蛋白結合的 EB 作為示蹤物質來觀察內皮屏障的通透性變化情況。本研究中脂多糖造模后EB染料的滲出明顯高于對照組,用川芎嗪治療后,EB染料的滲出有所緩解,表明川芎嗪對急性肺損傷肺血管通透性有治療作用。本研究通過Western Blot實驗技術檢測各處理組肺組織中的P-mTOR和RhoA蛋白表達量,結果發現脂多糖處理后mTOR/GAPDH與RhoA/GAPDH明顯升高,川芎嗪治療后下降,這與之前的研究報道相一致[20]。

川芎嗪是中藥川芎的主要有效成分,其化學式為C8H12N2,又名四甲基吡嗪(TMP)。川芎嗪能提高免疫功能,具有抗炎、抗血小板聚集、抗凋亡作用,常用于心血管系統疾病和呼吸系統疾病的治療[24]。在肺相關研究中,TMP 可有效降低 LPS 誘導的小鼠肺損傷,包括降低肺濕干比以及促炎因子和 TLR4 的表達[25]。在本研究中我們證實 TMP 可以顯著改善脂多糖誘導的 ALI 小鼠炎癥反應,減輕肺部炎癥細胞的浸潤,降低 BALF 中的蛋白質濃度、總細胞數、中性粒細胞數。此外,TMP 可以在體內和體外抑制巨噬細胞的焦亡和凋亡[26]。這些結果為TMP治療ALI的可行性提供了可靠依據。前期我們在細胞實驗內已經證實川芎嗪可以減少脂多糖引起的臍靜脈內皮細胞mTOR表達及細胞骨架應力纖維增多并可逆轉脂多糖導致的內皮細胞單層細胞通透性增加和TEER降低[27]。血管內皮細胞屏障功能失調和由此造成的肺血管通透性增加是急性肺損傷的基本特征,川芎嗪可以改善內皮細胞功能障礙對急性肺損傷的治療至關重要,綜上,TMP可以減少促炎因子的釋放,并可通過抑制mTOR/RhoA信號通路,減少應力纖維形成從而抑制細胞骨架重排,對血管內皮屏障起到保護作用。

綜上,川芎嗪對脂多糖誘導的急性肺損傷有治療作用,并且可以抑制mTOR/RhoA信號通路對脂多糖引起的肺血管通透性增加有治療作用。川芎嗪可以通過影響細胞骨架改善肺血管通透性,從而緩解肺損傷引起的炎性因子及蛋白的滲漏作用。