外周血T淋巴細胞亞群變化對于慢阻肺患者急性加重期相對危險性的評價

唐文君 曾珠 孫增濤 楊洪靜 楊帆

慢性阻塞性肺疾病 (chronic obstructive pulmonary disease,COPD) 是一種進行性、使人衰弱且高度普遍的疾病,發(fā)病機制非常復(fù)雜,一般認為其主要特征是氣道、肺實質(zhì)和肺血管的慢性炎癥反應(yīng)[1]。其特征是肺破壞、氣道重塑和粘液分泌過多[2]。COPD 在短時間內(nèi)出現(xiàn)呼吸功能和癥狀的發(fā)作性惡化,稱為 COPD 急性加重期(acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD)。加重的原因包括氣道細菌、病毒和污染以及這些誘因之間的相互作用,通常會導(dǎo)致肺功能加速下降、生活質(zhì)量下降以及死亡率增加[3]。據(jù)報道,AECOPD 與呼吸道微生物有關(guān),其中一些來自環(huán)境觸發(fā)因素,然而,全身性糖皮質(zhì)激素治療的急性有益作用表明,過度活躍的炎癥反應(yīng)比微生物更可能決定 AECOPD 的癥狀[4]。目前,還沒有專門的治療方法,其臨床應(yīng)用的主要目的只是為了緩解患者的癥狀。肺功能的測定是COPD診斷的金標準,但急性加重期患者需要結(jié)合其他生物標志物進行綜合診斷。有研究證實,COPD屬于混合免疫反應(yīng),該疾病的免疫反應(yīng)包括先天免疫和適應(yīng)性免疫,涉及巨噬細胞、中性粒細胞和T淋巴細胞[5]。除此之外,吸煙可以激活免疫細胞釋放炎癥介質(zhì),進而加速疾病的進程[6]。本文旨在通過比較分析AECOPD患者肺功能指標、血生化指標和外周血T淋巴細胞亞群變化,探討其在COPD急性加重中的作用,以提高COPD患者的治療效果和預(yù)后。

資料與方法

一、研究對象

選取2019年9月至2022年6月收治于我院的98例COPD患者作為研究對象,根據(jù)患者病情,將短期內(nèi)出現(xiàn)氣促、咳嗽、喘息、伴膿性或黏液膿性痰等呼吸道癥狀急性惡化,并出現(xiàn)發(fā)熱等炎癥加重表現(xiàn),超出日常變異范圍的患者納入AECOPD組(63例,男性31例,女性32例),將氣短、咳嗽、咳痰等癥狀輕微或穩(wěn)定的患者納入COPD組(35例,男性18例,女性17例),AECOPD組年齡45～95歲,平均年齡(72.69±4.45)歲;COPD組年齡45～94歲,平均年齡(71.55±5.69)歲。本研究經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批通過(ChiECRCT20200195)。

二、納入標準和排除標準

AECOPD組患者納入標準:(1)年齡≥45歲。(2)支氣管擴張劑后一秒用力呼氣量 (FEV1) ≤ 70 %。(3)連續(xù)每天咳嗽≥3個月。(4)在過去三年中,每年至少有一次 AECOPD 需要就醫(yī)和更換藥物(添加口服糖皮質(zhì)激素、抗生素)。(5)呼吸系統(tǒng)癥狀在短時間內(nèi)出現(xiàn)惡化,如呼吸短促、咳嗽、喘息、痰增多,需要對患者進行額外治療或改變治療方法。COPD組患者納入標準:(1)年齡≥45歲。(2)符合2013年修訂版《慢性阻塞性肺疾病診治指南》中關(guān)于COPD的診斷標準。(3)近3個月內(nèi)氣短、咳嗽、咳痰等癥狀輕微或穩(wěn)定,不需要調(diào)整用藥方案。排除標準:(1)有嚴重認知障礙。(2)不穩(wěn)定的心臟病、中風(fēng)、氣胸或血腫。(3)有癌癥、哮喘、囊性纖維化或靜脈功能不全患者。(4)使用骨合成材料或無法進行評估的患者。(5)肺結(jié)核和甲型流感患者。(6)有臨床意義的支氣管擴張、肺癌或其他炎癥或纖維化肺部疾病。

三、檢測方法

肺功能參數(shù)水平檢測:利用肺功能儀并由專業(yè)人員指導(dǎo)操作,測定以下指標:用力肺活量占預(yù)計值百分比(FVC%)、第 1 秒用力呼氣容積占預(yù)計值百分比(FEV1%)及二者的比值百分比(FEV1/FVC%),上述數(shù)據(jù)均需重復(fù)三次獲得。采集入院時患者的血液,采用全自動血液分析儀(南京巴登邁瑞醫(yī)療有限公司)檢測患者血常規(guī)參數(shù),酶聯(lián)免疫吸附測定來確定血清上清液中炎癥生物標志物的水平。利用流式細胞儀鑒定外周血中的淋巴細胞,取靜脈抗凝液,4000 rpm離心10 min,取血漿入試管,加入相應(yīng)抗體,用PE和FITC標記T淋巴細胞,室溫孵育15 min。加入適量紅細胞裂解液,37℃水浴20 min,加入磷酸鹽緩沖液洗滌細胞。離心后用流式細胞儀(CytoFLEX,中國貝克曼庫爾特貿(mào)易有限公司)檢測免疫T細胞亞群并進行分析。

四、觀察指標

收集患者臨床資料,包括年齡、性別、吸煙史、肺功能指標、嗜酸性粒細胞(Eosinophil,EOS)、C-反應(yīng)蛋白 (C-reaction protein,CRP)、中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio,NLR)、身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、營養(yǎng)風(fēng)險篩查(nutrition risk screening,NRS 2002)評分以及全身免疫炎癥指數(shù)(systemic immune-inflammation index,SII)、聯(lián)合預(yù)后營養(yǎng)指數(shù)(prognostic nutritional index,PNI)、外周血淋巴細胞亞群的水平包括T細胞(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、Treg、Th17)、自然殺傷細胞(natural killer cell,NK 細胞) CD3-CD56+和自然殺傷細胞T細胞(Natural killer T cell,NKT細胞)CD3+CD56+。NRS 2002考慮了疾病的嚴重程度和營養(yǎng)狀況受損,營養(yǎng)狀況受損包括體重下降、食物攝入量減少和BMI降低,分數(shù)越高則代表受損越嚴重[7]。SII為血小板計數(shù)×中性粒細胞/淋巴細胞計數(shù),PNI是一種新的預(yù)后評分,通過白蛋白×淋巴細胞計數(shù)計算得出,反映患者的炎癥和營養(yǎng)狀況[8]。

五、隨訪及診斷標準

通過電話等線上聯(lián)系方式或門診復(fù)診等方式對患者病情進行1個月隨訪,每周隨訪 1 次并進行NRS 2002評分。AECOPD被定義為呼吸系統(tǒng)癥狀(呼吸困難、咳嗽和痰量增加或化膿)出現(xiàn)急性惡化,需調(diào)整治療方案,額外增加抗生素、口服糖皮質(zhì)激素或兩者同時使用對患者進行治療,并通過體檢和胸部X線片以排除肺炎。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者臨床資料的比較

經(jīng)統(tǒng)計分析,兩組患者在年齡、性別和FVC%方面無明顯差異(P>0.05);但在吸煙史、FEV1/FVC、FEV1%、SII、PNI、BMI、NRS2002 評分方面具有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。AECOPD組中有吸煙史、SII、NRS2002 評分和WBC、NEUT、EOS、CRP、NLR水平明顯高于COPD組,FEV1/FVC、FEV1%、PNI、BMI均顯著低于COPD組(見表1)。

表1 兩組患者臨床資料的比較

二、兩組患者外周血T淋巴細胞亞群比較

根據(jù)兩組患者外周血淋巴細胞亞群的比較結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩組患者在T細胞、NK和NKT細胞百分比方面均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),AECOPD組的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Treg水平顯著低于COPD組,CD8+、Th17、CD3-CD56+、CD3+CD56+水平高于COPD組(如表2)所示。

表2 兩組患者外周血淋巴細胞亞群比較

三、外周血T淋巴細胞亞群變化與AECOPD相關(guān)性

將上述(表2)具有統(tǒng)計學(xué)意義的指標經(jīng)過多因素Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn),外周血T淋巴細胞亞群與慢阻肺患者急性加重有一定的相關(guān)性;其中CD8+、Th17、CD3-CD56+、CD3+CD56+水平增加是引起急性加重的獨立影響因子(OR>1,P<0.05);CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Treg水平增加為保護因素(OR<1,P<0.05),結(jié)果(如圖1)。

圖1 影響慢阻肺患者急性加重的危險因素森林圖

四、模型構(gòu)建

根據(jù)多因素分析結(jié)果,將CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、Treg、CD8+、Th17、CD3-CD56+、CD3+CD56+水平作為第一層的輸入變量,每個變量都連接到隱藏層中的所有節(jié)點H(1∶1)到H(1∶4),將結(jié)局指標作為輸出層,與隱藏層節(jié)點相連。線條的粗細程度與各指標對輸出結(jié)局的重要性成正比,結(jié)合(圖2)可知,CD8+、Th17、CD4+/CD8+和CD3-CD56+所占權(quán)重均較高。

圖2 慢阻肺患者急性加重的人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)圖

五、模型驗證

1 模型區(qū)分度評價 采用ROC曲線評價預(yù)測模型的區(qū)分度,訓(xùn)練集AUC為0.724(95%CI:0.619～0.833,P<0.001)(見圖3A),C-index為0.828。驗證集AUC為0.774(95%CI:0.669～0.815,P<0.001)(見圖3B),C-index為0.847。預(yù)測模型在訓(xùn)練集和驗證集中的C-index均>0.75,模型區(qū)分度較高。

圖3 預(yù)測模型的ROC曲線 A:訓(xùn)練集ROC曲線;B:驗證集ROC曲線

2 校準度評價 對預(yù)測模型進行Hosmer-Lemeshow擬合優(yōu)度檢驗:在訓(xùn)練集中χ2=7.084,P=0.687(圖4A);在驗證集中χ2=4.874,P=0.663(圖4B),無明顯差異(P>0.05)。

圖4 預(yù)測模型的校準度 A:訓(xùn)練集校準曲線;B:驗證集校準曲線

3 臨床決策曲線 臨床決策曲線顯示預(yù)測模型遠離極端曲線,當閾概率在12%～94%時使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)架構(gòu)圖預(yù)測模型預(yù)測慢阻肺患者急性加重的凈獲益率高(圖5A),而在驗證集中,閾概率在11%～98%范圍內(nèi)凈獲益高(圖5B),由此可見模型安全可靠,實用性強。

圖5 預(yù)測模型的決策曲線分析 A:訓(xùn)練集臨床決策曲線;B:驗證集臨床決策曲線

六、T淋巴細胞亞群及免疫細胞表達與AECOPD患者肺功能指標的相關(guān)性

采用 Pearson 相關(guān)分析顯示,CD8+、NEUT與AECOPD患者FEV1%、FEV1/FVC呈負相關(guān)(P<0.05),Th17與患者FEV1%呈負相關(guān)(P<0.05),Treg與患者FEV1%、FEV1/FVC呈正相關(guān)(P<0.05),CD4+/CD8+與患者FEV1%呈正相關(guān)(P<0.05)(見表3)。

表3 T淋巴細胞亞群及免疫細胞表達與AECOPD患者肺功能指標的相關(guān)性

討 論

COPD是一種與異常免疫反應(yīng)相關(guān)的炎癥性疾病,會導(dǎo)致氣流阻塞。引起的主要原因是吸煙、遺傳和環(huán)境因素,如長期吸入有毒顆粒和氣體會導(dǎo)致肺實質(zhì)破壞,激活上皮細胞,增加粘液產(chǎn)生并刺激許多炎癥細胞的遷移[9-10]。這會導(dǎo)致小氣道和肺泡出現(xiàn)異常炎癥反應(yīng),其中涉及許多炎癥細胞,包括中性粒細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞。T淋巴細胞廣泛存在于COPD患者的肺泡壁中,是COPD患者中央氣道和肺實質(zhì)的主要炎癥細胞,與患者肺泡損傷數(shù)量和氣道阻塞和疾病嚴重程度相關(guān)[11-13]。

在COPD的發(fā)病機制中確定了不同的T細胞亞群,有研究已在 COPD 受試者的氣道和血液中觀察到CD4+和CD8+的數(shù)量和質(zhì)量變化,COPD患者氣道和肺組織中積累的CD4+T淋巴細胞主要類型為Th1,可通過分泌炎癥細胞因子和趨化因子引起肺組織破壞,導(dǎo)致肺氣腫[14]。CD8+細胞的增加是T淋巴細胞浸潤氣道和肺部的主要特征,CD8+細胞與氣道限制及疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),COPD急性加重的特征是肺中 CD8+的細胞毒性潛能或細胞因子產(chǎn)生能力增加。除了局部炎癥,在 COPD 惡化期間,這種全身炎癥的強度也會增加[15]。故在本文研究對比兩組患者SII指數(shù)時,急性加重組要顯著高于COPD組。幾份報告表明,支氣管阻塞增加與肺 CD8+產(chǎn)生的干擾素 IFN-γ增加及其細胞毒性分子表達增加相關(guān)[16];除此之外,在患者氣道和肺部積聚的CD4+細胞也產(chǎn)生IFN-γ,因此具有Th1表型[17]。然而,COPD受試者的肺顯示促炎性T輔助細胞Th17細胞的積累,類似于自身反應(yīng)性免疫反應(yīng)[18]。目前的研究表明,Th17和Treg亞群的關(guān)鍵作用與免疫病理學(xué)炎癥有關(guān),產(chǎn)生作為促炎效應(yīng)細胞的Th17細胞與在外周耐受和炎癥下調(diào)中充當效應(yīng)細胞的Treg細胞之間的不平衡可能有助于炎癥的進展[19]。Treg細胞是 CD4+的一個子集表達轉(zhuǎn)錄因子forkhead-box-P3 (FoxP3)并參與維持對自身抗原的耐受性和消除自身免疫反應(yīng)的 T 細胞,Treg細胞的分化依賴于多種信號,例如來自細胞因子的信號(即白細胞介素-2、轉(zhuǎn)化生長因子-β )以及T 細胞抗原受體和共刺激分子[20-21]。由于Treg在控制自身免疫反應(yīng)中發(fā)揮核心作用,導(dǎo)致 FoxP3 剪接形式的表達下降以及Treg細胞生成和功能受損。

吸煙也可能導(dǎo)致免疫反應(yīng)的激活,進而導(dǎo)致肺中Th1和Th17 CD4+的產(chǎn)生,在這種情況下,慢性炎癥性疾病和自身免疫的免疫發(fā)病機制與自身反應(yīng)性 T 細胞的過度活躍和主要由Treg細胞介導(dǎo)的局部調(diào)節(jié)機制的失敗有關(guān)[22]。在與COPD相關(guān)的環(huán)境因素中,營養(yǎng)狀況最近被認為是疾病發(fā)病機制的促進因素。事實上,全身炎癥反應(yīng)在COPD患者急性加重期進一步被激活,高水平炎癥因子的表達有利于促進多種蛋白質(zhì)分解代謝過程,加快患者在靜息狀態(tài)下的能量消耗,使患者出現(xiàn)營養(yǎng)不良的情況,從而導(dǎo)致BMI降低,機體抵抗力下降,加重患者感染情況和病情,形成惡性循環(huán)[23]。而COPD的氣道免疫炎癥反應(yīng)主要由T淋巴細胞介導(dǎo),初始T淋巴細胞分化出Th17和Treg兩大細胞亞群,二者共同維持機體的免疫平衡,因此提示Th17和Treg細胞的免疫代謝在COPD的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[24]。

綜上所述,外周血T淋巴細胞亞群變化在COPD病情發(fā)展過程中有重要參考價值,與病情的急性加重有較大的相關(guān)性,對患者的治療和預(yù)后具有十分重要的預(yù)測價值,為AECOPD的臨床診斷和免疫治療提供研究思路。