干擾TAK1通過下調TAB2/3來抑制肺成纖維細胞的增殖、侵襲、遷移和纖維化

章艷菊 周小娣 夏云飛

肺纖維化(plumory fibrosis,PF)不僅是一種疾病,而且是其他多種慢性肺部疾病的終末期病理改變[1]。PF是多種慢性肺部疾病致殘和死亡的主要原因[2]。PF是一種不可逆的間質性疾病,特別是特發性纖維化,患者的平均生存時間只有2.8年[3]。因此,PF的發生發展機制及治療方案正在被不斷深入研究中。

TGF-β激活激酶1(TGF-β activated kinase 1,TAK1)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein 3 kinase,MAP3K)家族的一個成員MAP3K7。它在免疫反應、炎癥反應和纖維化等疾病中起著重要的作用[4-5]。TAK1作為NF-κB信號通路的關鍵上游因子,可被轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、Toll樣受體等因子激活[6]。在成年小鼠腎組織中TAK1可激活的JNK、p38和NF-κB,促進腎間質肌成纖維細胞的積累和膠原沉積[7]。TAK1在塵肺患者和硅暴露大鼠的肺組織以及大鼠的肺泡巨噬細胞中過表達,可加重肺部炎癥和纖維化[8]。然而,據我們所知,TAK1在PF中的作用尚未被研究。

通過檢索蛋白質相互作用分析數據庫STRING和通用生物學互作資源數據庫BioGRID,發現TAK1與TAK1結合蛋白(TAK1-binding protein,TAB)2/3共表達,并可以與TAB2/3結合;PF患者中TAB2/3的表達增加[9-10]。因此,我們推測TAK1可以調控TAB2/3,促進PF的進展。因此,本研究中,主要討論TAK1在TGF-β1誘導的肺成纖維細胞增殖、侵襲、遷移和纖維化中的作用,并探討了其機制,以期為PF治療提供新的靶點。

資料與方法

一、實驗材料與方法

1 細胞培養、分組及轉染:人胚肺成纖維細胞(human fetal lung fibroblast 1,HFL-1;武漢普諾賽生命科技有限公司),在DMEM(Biological Industries)中添加10%胎牛血清(Biological Industries)進行培養,培養條件:37 ℃,5% CO2,濕度飽和。分組:Control組(未進行任何處理HFL-1)、TGF-β1組(10ng/mL TGF-β1誘導HFL-1)、TGF-β1+si-NC組(轉染si-NC+TGF-β1誘導)、TGF-β1+si-TAK1組(轉染si-TAK1+TGF-β1誘導)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1組(轉染si-TAK1+pcDNA3.1+TGF-β1誘導)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2組(轉染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB2+TGF-β1誘導)、TGF-β1+si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3組(轉染si-TAK1+pcDNA3.1-TAB3+TGF-β1誘導)。TGF-β1組用10 ng/mL TGF-β1 (MedChemExpress)處理細胞48 h。使用Lipofectamine 2000試劑將si-NC、si-TAK1、pcDNA3.1、pcDNA3.1-TAB2、pcDNA3.1-TAB3轉染至HFL-1后,用10 ng/mL TGF-β1處理細胞后進行后續實驗。

2 羥脯氨酸含量(hydroxyproline,HYP)測定:根據檢測試劑盒(Biovision,Mountview,CA)說明,通過測定羥脯氨酸來評估培養細胞中的膠原蛋白含量。

3 數據庫:STRING數據庫(www.string-db.org)[11]和BioGRID數據庫(thebiogrid.org)[12]檢測TAK1和TAB2/TAB3之間的關系。

4 Western-Blot:使用BCA試劑盒(賽默飛世爾科技公司)檢測蛋白質濃度。根據所測蛋白濃度,每孔吸取30 μg蛋白裝載到10%的SDS-PAGE凝膠上。凝膠電泳后,將蛋白轉移到PVDF膜上,然后用5%牛血清白蛋白在室溫下封閉30 min。然后用一抗在4 ℃下孵育過夜。使用的一抗如下:α-平滑肌肌動蛋白 (α-smooth muscle actin,α-SMA;Abcam),TAK1 (Abcam),基質金屬蛋白酶2 (matrix metalloproteinase 2,MMP2;Abcam),基質金屬蛋白酶9 (MMP9;Abcam),纖維連接蛋白1 (fibronectin 1,FN1;Abcam),Ⅰ型膠原蛋白 (collagen,ColⅠ;Abcam),Ⅲ型膠原蛋白 (ColⅢ;Abcam),TAB2(Abcam),TAB3(Abcam)和GAPDH(Abcam)。在與二抗(Abcam)孵育1.5 h。ECL發光,掃描圖像,Image J 分析條帶灰度值。

5 逆轉錄-定量PCR(reverse transcription-quantitative PCR,RT-qPCR):根據說明書使用TRIzol?試劑盒(賽默飛世爾科技公司)從HFL-1細胞中獲得總RNA。cDNA合成使用M-MLV第一鏈合成試劑盒(賽默飛世爾科技公司)。根據一步法RT-qPCR試劑盒(SYBR Green)(賽默飛世爾科技公司)進行PCR擴增。所使用的熱循環條件為:95 ℃,2 min,后95 ℃,20 s;60 ℃,15 s;72 ℃,30 s循環40次。相對基因表達量采用2-ΔΔCt方法[13]。以GAPDH作為內參基因。用于序列檢測的特異性引物如下:TAK1正向:5′-ACTCACTTGATGCGGT-3′,反向:5′-CGGCGATCCTAGCTTC-3′;TAB2 正向:5′-AGTACAAGATATCTTTATGG-3′,反向:5′-TGCTGTCTGTGGCTCCTGCT-3′;TAB3正向:5′-GCAAGGATGGAGAGGTTAGCA-3′,反向:5′-GTCATTTCCTCAGGCGTAGGG-3′;GAPDH 正向:5′-GAGCCCGCAGCCTCCCGCTT-3′,反向:5′-CCCGCGGCCATCACGCCACAG-3′。

6 CCK-8(cell counting kit-8):使用CCK-8試劑盒(Dojindo Molecular Technologies)測定細胞增殖活性。將細胞以5×103個/孔的密度接種到96孔板中在37 ℃條件下過夜生長。然后轉染(如上所述),用TGF-β1處理,然后加入10 μL的CCK-8溶液。然后將細胞孵育3小時,使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度(Bio-Rad Laboratories,Inc.)。

7 細胞劃痕實驗:HFL-1細胞在6孔板中培養,直到它們在含有10%胎牛血清DMEM中融合達到100%。使用移液槍頭尖端在單層細胞進行劃痕。用PBS洗滌細胞3次,并在含無血清培養基的培養箱中培養。0和24 h時,使用光學顯微鏡獲得連續圖像。通過測量細胞的遷移距反映細胞的遷移能力。

8 Transwell實驗:HFL-1細胞用無血清培養基處理12 h,重懸細胞。計數后調整細胞密度至5×105/mL。Transwell小室放置24孔板(Corning,Inc)中,將細胞懸液(200 μL)加 入上室,下室加入500 μL含有 10%胎牛血清的DMEM培養。取出 Transwell 小室,棄去培養液,用棉簽去除上層未通過膜的細胞后加入4%多聚甲醛在室溫下固定細胞15 min。將膜底部的細胞用結晶紫染料在室溫下染色。在顯微鏡下計數侵襲的細胞。

9 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP):Co-IP使用Pierce免疫共沉淀試劑盒(Thermo Fisher Scientific,Inc.)。細胞裂解液中加入抗體,經過洗脫,收集免疫復合物,然后進行SDS-PAGE及Western Blot分析。以抗IgG抗體作為陰性對照。TAK1,TAB2 和 TAB3 抗體作為一抗,山羊抗兔IgG,(北京康為世紀生物科技有限公司)作為二抗進行免疫印跡分析。

二、統計分析

結 果

一、抑制TAK1表達對HFL-1細胞增殖的影響

TGF-β1誘導HFL-1后細胞增殖,逐漸轉化為扁平狀纖維結構的肌成纖維細胞。與Control組比較,TGF-β1組ColⅠ和α-SMA蛋白表達水平均明顯增加(P<0.001)(圖1A),并通過HYP檢測到膠原蛋白含量增加(圖1B),細胞模型誘導成功。與Control組比,TGF-β1組的TAK1表達增加(圖2)。在未經處理的HFL-1中轉染si-TAK1,與si-NC組相比,在si-TAK1-1和si-TAK1-2組中TAK1的表達顯著下降,si-TAK1-2組更明顯。與TGF-β1+si-NC組比,TGF-β1+si-TAK1組中TAK1的表達降低,且si-TAK1-2組的表達降低更明顯(P<0.001)(圖3A,B),后續的實驗采用si-TAK1-2。CCK-8結果顯示,與Control組比較,TGF-β1組明顯增殖;與TGF-β1+si-NC組比,TGF-β1+si-TAK1-2組增殖下降(P<0.05)(圖3C)。

圖1 ColⅠ、α-SMA和HYP表達水平

圖2 TAK1的表達 A:TAK1mRNA表達;B,C:TAK1蛋白表達。與Control組比:***P<0.001

圖3 si-TAK1對HFL-1細胞增殖的影響

二、抑制TAK1表達對HFL-1細胞的侵襲、遷移和纖維化的影響

Transwell和細胞劃痕實驗顯示,與Control組比,TGF-β1組細胞的侵襲和遷移明顯增加;與TGF-β1+si-NC組相比,TGF-β1+si-TAK1-2組的細胞侵襲和遷移顯著減弱(圖4A～D)。與Control組比,TGF-β1組遷移相關蛋白(MMP2,MMP9)和纖維化相關蛋白(FN1,ColⅠ,Col Ⅲ)的表達增加;與TGF-β1+si-NC組相比,TGF-β1+si-TAK1-2組遷移和纖維化相關蛋白的表達下降(MMP2,MMP9,P均<0.001;FN1,P=0.007,ColⅠ,P<0.001,Col Ⅲ,P=0.006)(圖4E～F)。結果表明si-TAK1抑制TGF-β1誘導HFL-1細胞的侵襲、遷移和纖維化。

圖4 si-TAK1對HFL-1細胞侵襲、遷移和纖維化影響 A:遷移能力檢測(×100);B:細胞遷移率;C:侵襲能力檢測(結晶紫染色,×100);D:細胞侵襲率;E:遷移相關蛋白表達;F:纖維化相關蛋白表達。與Control組比較,***P<0.001;與TGF-β1+ si-NC組比較,###P<0.001

三、干擾TAK1對TAB2/3表達的影響

利用STRING和BioGRID數據庫發現TAK1與TAB2/3共表達(圖5A)。與Control組相比,TGF-β1組中TAB2/3的表達明顯增加(P<0.001)(圖5B～C)。Co-IP結果顯示,TAK1可以在HFL-1細胞中與TAB2/3結合。與Control組比,si-TAK1-2組TAB2/3表達明顯降低(P<0.001)(圖5D)。結果表明,si-TAK1可以抑制TAB2/3的表達。

圖5 si-TAK1對TAB2/3表達影響 A:TAK1和TAB2/3關聯圖;B-C:TAB2/3的mRNA和蛋白表達;D:si-TAK1后TAB2/3蛋白表達。與Control組比較,***P<0.001

四、過表達TAB2/3對si-TAK1-HFL-1細胞增殖、侵襲、遷移和纖維化的影響

在未經處理的HFL-1中轉染pcDNA3.1-TAB2/3,即過表達TAB2/3后,TAB2/3的表達顯著增加。與TGF-β1+pcDNA3.1組比,TGF-β1+pcDNA3.1-TAB2/3組TAB2/3表達顯著增加(P<0.001)(圖6A)。與TGF-β1+si-TAK1-2+pcDNA3.1組比,TGF-β1+si-TAK1-2+pcDNA3.1-TAB2/3組增殖、侵襲、遷移、遷移相關蛋白(MMP2、MMP9)和纖維相關蛋白(FN1、ColⅠ和Ⅲ)明顯增加(P均<0.05)(圖6B,7)。結果表明,過表達TAB2/3可以逆轉si-TAK1對HFL-1細胞增殖、侵襲、遷移和纖維化的影響。

圖6 過表達TAB2/3對HFL-1細胞增殖影響 A:各組TAB2/3表達;B:細胞增殖檢測。與Control組比較,***P<0.001;與TGF-β1組比較,##P<0.01,###P<0.001;與TGF-β1+si-TAK1-2+pcDNA3.1比較,ΔP<0.05

圖7 過表達TAB2/3對HFL-1細胞侵襲、遷移和纖維化影響 A:細胞遷移檢測(×100);B:細胞侵襲檢測(結晶紫染色,×100);C:細胞遷移率;D:細胞侵襲率;E:遷移相關蛋白表達;F:纖維化相關蛋白表達。與Control組比較,***P<0.001;與TGF-β1組:###P<0.001;與TGF-β1+si-TAK1-2+pcDNA3.1比較,ΔΔΔP<0.001

討 論

PF的主要病理特征之一是過度增殖和肺成纖維細胞轉化[14]。TGF-β1是誘導PF形成的關鍵細胞因子之一。它可以啟動肺成纖維細胞的激活,并調節它們的增殖、遷移和分化[15-16]。多項研究表明,肺纖維化過程中TGF-β1水平升高,TGF-β1可促進肺成纖維細胞的增殖、侵襲和遷移,合成膠原,促進膠原在肺組織中的沉積[17-19]。因此,本研究采用TGF-β1誘導HFL-1細胞,顯著增加了其增殖、侵襲和遷移,顯著增加了Col I和α-SMA的表達水平,并通過HYP檢測到膠原蛋白含量增加。結果表明細胞模型構建成功。

TAK1與體內的炎癥和應激有關,其在不同的人體組織中的表達也不同[20]。TAK1與人體正常的胚胎發育和神經系統修復有關[21-22]。抑制TAK1可以減少實驗性塵肺的炎癥和纖維化[8]。小鼠纖維化上皮細胞中TAK1和Zeste基因增強子同源物2的缺失或者阻斷核內肌動蛋白可減弱纖維化級聯反應并恢復呼吸穩態[23]。這些結果表明,抑制PF中TAK1的表達與PF的發生有關。此外,有研究表明,TAK1可以被TGF-β1等細胞因子激活。我們的實驗表明在用TGF-β1誘導HFL-1細胞后,細胞中TAK1的表達明顯增加。干擾細胞中TAK1的表達后,細胞的增殖、侵襲、遷移和纖維化均明顯降低。

TAB2/3已被證實在TAK1和上游TNF受體相關因子之間起重要作用[24]。此外,TAB2/3還被證實在引導TAK1依賴的MAP激酶激活中發揮作用[25]。利用STRING和BioGRID數據庫,還發現TAK1與TAB2/3共表達,TAK1可以調控TAB2/3的表達。此外,還驗證了TAK1與TAB2/3的結合。在PF患者中,TAB2/3的表達已被證明增加并參與了PF的過程[9-10]。本研究證實了在TGF-β1誘導的PF細胞中,TAB2/3的表達顯著增加。在PF模型中,TGF-β的表達增加,導致TAB2表達的激活[26]。本研究發現,過表達TAB2/3顯著減弱了TAK1干擾在TGF-β1誘導的HFL-1細胞中的保護作用,提示TAK1可能通過調控TAB2/3在IPF中發揮其作用。此外,我們還發現,轉染TAB2后,TAB3也增加了?？赡艿脑蚴荰AB2和TAB3是兩個同源的k63-多聚泛素結合的TAK1銜接蛋白,可能在脊椎動物進化的早期共享一個共同的祖先基因。這兩個同源的銜接蛋白對于TAK1的激活至關重要[27]。然而,具體的機制將在未來的實驗中進一步探索。

綜上所述,本研究結果顯示,干擾TAK1可能通過下調TAB2/3在TGF-β1誘導的成纖維細胞中發揮其保護作用。過表達TAB2/3可以逆轉TAK1干擾對HFL-1細胞增殖、侵襲、遷移和纖維化的影響。這些發現為靶向治療PF提供了堅實的理論基礎。但是目前通過何種信號通路且缺乏體內研究,這些都是我們需要繼續研究的方向。