參附對大鼠心肺復蘇術后肺損傷的保護作用及其機制的探究

陸輝志 李偉,2

在我國,隨著老齡化進程的加快以及人均壽命的延長,心血管疾病的發病率逐年上升,而心血管疾病最嚴重的后果為心臟驟停(cardiac arrest,CA)。CA患者即使在早期接受了有效的心肺復蘇(cardio-pulmonary resuscitation,CPR)治療并恢復了自主循環,最終能夠存活并出院的患者微乎其微[1]。CPR術后患者死亡通常是由于缺血/再灌注損傷引起的重要臟器衰竭,如心臟、大腦、腎或其他重要器官,而復蘇后肺水腫、呼吸衰竭是最常見的并發癥之一。

既往的研究表明,在休克及復蘇期間,參附注射液治療可以提升血壓,改善微循環,有助于減輕全身炎癥反應,進而減輕重要器官的缺血再灌注損傷[2]。此外,尚有報道顯示,參附注射液還具有一定的抗凋亡作用[3]。本研究通過構建CA模型,探討參附注射液對心肺復蘇術后肺損傷的保護作用及相關機制。

資料與方法

一、實驗材料

IGF-1:上海肯強貿易有限公司;TNF-α,IL-1β及IL-6 ELISA檢測試劑盒:武漢博士德生物技術有限公司;MDA及SOD檢測試劑盒:武漢博士德生物技術有限公司;一抗NF-κB-p65抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、GAPDH抗體及二抗山羊抗兔IgG均購自美國CST公司;多功能自動酶標儀購自美國Molecular Devices公司;高速臺式離心機購自美國Beckman公司;Western Blot儀器購自美國Bio-Rad公司;水浴恒溫搖床(SHY-2,江蘇),紫外分光光度計(CE 2041,英國),呼吸機(HX-200)及BL-420E+生物機能試驗系統(泰蒙公司,成都)。

二、實驗對象及方法

生產教育是1930年代初，尤其是1931年全國性大水災及“九·一八”事變后內憂外患背景下，政府當局與教育界上下呼應、合力提倡的教育主張，意在通過教育授予受教者生產技能，為社會生產事業提供技術人才，推動國民經濟的發展。教育史家舒新城認為，此時期中國教育思想的主要內容已“由治術教育轉變到生產教育”[1]。教育界關于生產教育的討論中，圍繞“生產”究竟是以農業生產還是工業生產為主，先后形成“農業為主”論、“工業為主”論以及“農工并重”論等三派觀點。

結果顯示，吸煙成癮組的男性比例高于其他兩組，網絡成癮組的女性比例高于其他兩組(χ2=29.066，P＜0.05)，3組被試在性別上差異有統計學意義。但在年級、民族、是否為獨生子女以及家庭所在地上比較，差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

四、參附減輕CPR術后肺組織細胞凋亡水平并抑制炎癥反應通路的激活

四、統計學處理

為了確保整個課堂教學都是有效的，在課前需要做好相應的準備工作，應該提前將和教學內容相關的素材全部準備好，只有這樣才可以提高本課程教學的有效性。一方面是教師準備，精心規劃課本的重點、難點、學習目標、問題設計以及學生實際情況等等，真正做到心中有數，為確保教學活動的正常進行奠定堅實的基礎。另外一方面是學生準備，首先應該整體感知課本內容，對本課程內容有初步的認識，找到其中的疑惑，進而在學習過程中得到高效的解決，促使課堂學習得到正常開展。

復蘇后24小時,2%戊巴比妥鈉過量麻醉大鼠,采集血液和肺組織。采集的血液在4℃下以3000 g離心20 min,收集上清液并儲存在-80℃冰箱直至測定。將部分肺組織用10%中性甲醛溶液固定后用于病理學分析,剩余的肺組織在液氮中快速冷凍并儲存在-80℃冰箱直至測定。

三、檢測指標

浙江省文聯黨組書記、副主席、書記處常務書記田宇原，中國文聯副主席、浙江省文聯主席、浙江省美術家協會主席許江，團省委副書記、浙江省青聯副主席周蘇紅，浙江省文聯黨組成員、書記處書記徐曉等領導，全山石、高士明、吳山明、鄔繼德、孫永、應金飛、尉曉榕、楊參軍、張曙光、井士劍、孔國橋、楊勁松、周崇漲等知名美術家出席開幕式。浙江省美術家協會副主席兼秘書長駱獻躍主持開幕儀式，周蘊智、全山石、孫永、許江分別代表青年美展作者、老一輩美術家、展覽評委會和主辦方先后致辭。

1 肺組織病理學分析 肺組織經甲醛固定,石蠟包埋后切片。脫蠟、脫水后蘇木精、伊紅染色,在光學顯微鏡下觀察組織學特征。主要觀測指標為肺泡壁厚度、血管充血、肺泡內滲出及肺間質炎細胞浸潤。每個組織學特征按無損傷、輕度損傷、中度損傷至重度損傷4個等級進行評分:0～3分,將4個組織學特征的評分相加即為急性肺損傷(ALI)評分。

2 濕/干重比值測定 取適量肺組織,用吸水紙吸干后稱重,即濕重;然后將其放入110℃烤箱中,烘烤24 h后再次稱重,即干重。計算濕重與干重的比值。

3 血清炎癥因子測定 采用ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程公司)測定血清炎性細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6的含量。用酶標儀進行檢測,以吸光度值計算濃度,結果表示為pg/mL。

4 肺組織氧化應激指標測定 取適量肺組織,加入適量的生理鹽水和蛋白酶抑制劑,超聲波破碎儀研磨勻漿,離心后取上清,按照試劑盒說明書(武漢博士德生物工程公司),采用比色法檢測肺組織丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量及SOD 活性。

5 Western Blot分析 取適量肺組織,按比例加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制劑,超聲波破碎儀研磨勻漿,4℃ 12000 g離心5 min,取上清液,BCA法測蛋白濃度,以30ug蛋白上樣量計算上樣體積。加上樣緩沖液后煮沸10 min使蛋白變性。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉移蛋白至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入一抗Bcl-2(1∶1000,CST公司)、Bax (1∶1000,CST公司)、磷酸化的NF-κB P65(1∶1000,CST公司)及GAPDH(1∶1000,CST公司),4℃孵育過夜。TBST洗膜(10 min×3次),加入相對應的二抗山羊抗兔IgG(1∶3000,CST公司),室溫孵育1 h,ECL試劑發光顯色,拍照,Image J軟件分析測定條帶灰度值。以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,仰臥位固定,標準肢體導聯監測心電。氣管切開插管;分離右頸動脈,接多導心電監護儀監測平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP);分離右側股靜脈,24號留置針穿刺置管,肝素封管備用。所有插管完成后穩定15 min,通過窒息法誘導CA[4]:于呼氣末夾閉氣管導管直至大鼠心臟停搏。心臟停搏的觀測標準為:心電圖顯示心電靜止、室顫、電機械分離;心尖區心臟搏動消失或MAP低于20 mmHg。心搏停止6 min后開始心肺復蘇,以食指按壓胸部,200次/min;同時恢復機械通氣,呼吸頻率為50次/min,潮氣量6 mL/kg,吸氧濃度100%;經股靜脈注射腎上腺素(0.01 mg/kg);如有必要,給予電除顫(5 J)。如第一次除顫后不能恢復自主心跳,則在30 s后重復一次。CPR成功標準:心電圖出現正常的QRS波群、可觸及到明顯的心臟搏動或MAP升至60 mmHg以上。如心肺復蘇5 min未成功,則停止復蘇,宣告死亡。在復蘇成功后,按分組給予不同的干預措施,CPR+SF組經股靜脈置管給予1 mL/kg的參附注射液,CPR組給予等同劑量的生理鹽水。Sham組及Sham+SF組只置管,不誘導心臟停搏,不復蘇,在對應的時間點按分組進行干預。給藥后繼續進行6 h的生命支持治療,然后拔除所有導管,大鼠歸籠,持續觀察至復蘇后24 h。

經過混凝沉淀工藝后，水廠A和B中均無MK檢出。而水廠A和B的混凝沉淀工藝對HHCB的去除率分別為65.09%和28.53%，對AHTN的去除率分別為31.00%和27.75%。這可能是由于水廠A和B在混凝池與沉淀池的形狀上有所不同，相比于水廠B采用的網格混凝池和斜管沉淀池，水廠A采用的折板混凝池和平流沉淀可能更加利于對HHCB與AHTN的去除。在A廠中，水流通過折板之間速度一般沿程減小，相對B廠水流條件可能比較穩定，絮凝時間較長，對HHCB與AHTN等易吸附于顆粒表面的有機物，混凝效果更好。然而，混凝效果與混凝池設計、原水等多方面因素有關，可在后續研究中進一步探索。

結 果

一、參附減輕大鼠CPR術后肺損傷

體積隨壓力的變化關系由三階Brich-Murnaghan方程擬合，其中三階Brich-Murnaghan方程表示為[19]：

四組大鼠肺組織病理學分析顯示,Sham組及Sham+SF組大鼠肺泡壁光滑完整,少見斷裂;肺泡間隔均勻一致,無明顯增厚;血管無充血;肺泡腔及肺泡間隔內少見中性粒細胞浸潤,ALI評分均為輕度損傷[Sham組:(1.58±0.39)分;Sham+SF組:(1.72±0.30)分]。CPR組可見肺泡壁斷裂,肺泡間隔明顯增厚,肺泡腔中可見滲出及炎性細胞浸潤,部分肺泡萎陷不張,ALI評分顯示為中至重度損傷[Sham組(1.58±0.39 )分vsCPR組(6.88±0.77)分,P<0.001]。參附注射液治療后肺組織充血水腫及炎細胞浸潤減少,肺損傷評分為輕中度損傷,與CPR組之間差異有統計學意義[CPR組 (6.88±0.77) 分vsCPR+SF組(5.31±0.70)分,P<0.001](如圖1 A,B)

肺組織濕/干重比值測定表明,與Sham組相比,CPR組及CPR+SF組濕/干重比值顯著升高[Sham組(3.69±0.23)vsCPR組(5.39±0.47),P<0.001; Sham組(3.69±0.23)vsCPR+SF組(4.82±0.40),P<0.001],而CPR+SF組較CPR組明顯下降[CPR組(5.39±0.47)vsCPR+SF組(4.82±0.40),P=0.002],差異有統計學意義(如圖1C)。

血清炎癥因子測定結果顯示,Sham組及Sham+SF組血清炎癥因子含量較低,與Sham組相比,CPR組及CPR+SF組血清炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6含量均顯著升高。而參附干預后,三種血清炎癥因子濃度均有不同程度下降[TNF-α:CPR組(408.33±30.74)pg/mLvsCPR+SF組(312.11±41.27)pg/mL,P<0.001;IL-1β:CPR組(100.67±8.51)pg/mLvsCPR+SF組(69.33±9.11)pg/mL,P<0.001;IL-6:CPR組(316.11±29.54) pg/mLvsCPR+SF組(223.11±22.94)pg/mL,P<0.001],差異有統計學意義(如圖2)。

二、參附抑制CPR術后全身炎癥反應

圖2 各組大鼠血清炎癥因子TNF-α,IL-1β及IL-6含量比較 A:四組大鼠血清TNF-α含量比較;B:四組大鼠血清IL-1β含量比較;C:四組大鼠血清IL-6含量比較。與Sham組相比,*P<0.05;與CPR組相比,#P<0.05(n=9)

三、參附減輕CPR術后肺組織氧化應激損傷

肺組織MDA含量及SOD活性檢測表明,Sham組及Sham+SF組MDA含量較低,SOD活性較高,而CPR組及CPR+SF組MDA含量顯著增加,SOD活性明顯下降。與CPR組相比,SF治療后MDA含量下降[CPR組(98.00±5.74)μmol/gvsCPR+SF組(84.56±5.88)μmol/g,P<0.001],SOD活性則增加[CPR組(13.56±3.75)u/gvsCPR+SF組(20.44±3.91)u/g,P=0.002],差異有統計學意義(如圖3)。

圖3 各組大鼠肺組織氧化應激損傷比較 A:四組大鼠肺組織MDA含量比較;B:四組大鼠肺組織SOD活性比較。與Sham組相比,*P<0.05;與CPR組相比,#P<0.05(n=9)

36只清潔級雄性成年SD大鼠(上海斯萊克實驗動物有限公司,SCXK(滬)2017-0012),體重250～300 g,隨機分為4組(n=9):假手術組(Sham組),Sham+參附注射液治療組(Sham+SF組),心肺復蘇組(CPR組),CPR+參附注射液治療組(CPR+SF組)。相關動物實驗內容已通過動物實驗倫理委員會審查(武三醫實倫 SY2021-024),動物飼養在溫度、濕度相對恒定的SPF級動物房內[溫度(24±2)℃、濕度(55±5)%],12 h晝夜交替,自由進食水,術前禁食水8 h。

四組大鼠肺組織Western Blot檢測結果顯示:Sham組抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較高,凋亡蛋白Bax及磷酸化NF-κB-P65(P-P65)表達水平較低;與Sham組相比,CPR組及CPR+SF組Bcl-2表達水平下調,Bax及P-P65的表達量增加。而與CPR組相比,SF干預促進了Bcl-2的表達[CPR組(0.62±0.09)vsCPR+SF組(0.87±0.10),P<0.001],并顯著抑制了Bax[CPR組(0.84±0.06)vsCPR+SF組(0.54±0.07),P<0.001]及P-P65[CPR組(0.96±0.07)vsCPR+SF組(0.71±0.06),P<0.001]的表達(如圖4)。

2.2.6 家鄉經濟條件 一般家鄉經濟條件對勞動力外出務工意愿既有正向影響，又有負向影響。一方面，較好的家鄉經濟條件能夠給農村勞動力更寬的視野，使其渴望外出獲得更好的就業機會；另一方面，較好的家鄉經濟條件可能有較好的就業機會，降低其外出務工意愿。調查中，經濟條件較差的編碼為1，有44名，占22.9%；經濟條件一般的編碼為2，有92名，占47.9%；經濟條件較好的編碼為3，有56名，占29.2%。

平時教學中，總能發現，問題一提出，幾乎全班學生都舉手發言，看似流暢，實則說明問題的難度太低，學生思考的空間很小。課堂上為了促進學生深度思考，教師要提出對學生有挑戰性的問題。北京市特級教師張紅，在一次講座中提到教師要善于提出“胖”問題，也就是能夠引起學生發散思維和深度思考的問題。針對“正比例的意義”這節課，核心問題是找到“呈正比例的兩個量”有什么特征。這是個大問題，需要學生綜合分析變化情境，通過分析歸類，不斷抽絲剝繭，才能抽象出“正比例”的內涵。所以這個問題是一個有深度、對學生來說有挑戰的問題，能引起學生的深度思考。

圖4 各組大鼠肺組織凋亡蛋白及磷酸化NF-κB-P65表達水平比較 A:四組大鼠肺組織Bcl-2、Bax、P-P65蛋白條帶圖,B,C,D:Bcl-2、Bax、P-P65相對表達量,與Sham組相比,*P<0.05,與CPR組相比;#P<0.05(n=9)

討 論

本實驗通過構建大鼠CA模型,檢測肺組織病理改變、含水量、氧化應激損傷,以及血清炎癥因子含量、肺組織凋亡蛋白與炎癥蛋白表達水平,證明了參附注射液對CPR術后肺損傷具有保護作用,其機制可能與抗炎癥反應及抗凋亡有關。

隨著CPR技術的普及,越來越多的CA患者能夠及時的接受CPR治療,自主循環恢復的比例也有所提升,但最終存活下來并順利出院的患者卻并不多見[1],其中部分患者還遺留有嚴重的神經功能障礙及其他并發癥。復蘇后患者死亡的原因主要是由于全身缺血再灌注引起的心臟驟停后綜合征,而肺損傷是心臟驟停綜合征的一個重要表現[5]。

據統計,CPR術后肺損傷的發生率高達20%以上[5],它的出現與復蘇后患者死亡密切相關[6]。CPR術后肺損傷的致病機制極其復雜,目前尚未完全明確,已知的損傷因素包括機械損傷、吸入性損傷以及缺血再灌注損傷。機械損傷即胸部按壓直接導致的肺泡毛細血管膜破裂,引起肺出血和水腫。吸入性損傷是指復蘇過程中胃內容物的返流及口咽部分泌物誤吸導致的損傷。缺血再灌注損傷是復蘇后肺損傷最主要的致病機制,心臟停搏后組織缺氧、細胞內自由基生成增多,引起氧化應激損傷及內皮細胞功能障礙,在自主循環恢復后誘發再灌注損傷[6]。

缺血再灌注損傷是一個復雜的病理生理過程,涉及氧化應激反應、炎癥反應和細胞凋亡。心臟停搏后,全身組織器官缺血缺氧,氧化應激反應加重,活性氧介質(reactive oxygen species,ROS)蓄積,進而誘導內皮細胞活化、促進細胞因子分泌并激活循環中的中性粒細胞。在自主循環恢復以后,活化的中性粒細胞引起局部及全身的炎癥反應,與此同時,大量的促炎細胞因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6以及轉錄因子,包括NF-κ B迅速釋放,進一步加劇組織損傷[7]。此外,心臟停搏后機體內在抗氧化能力下降,加之大量的ROS蓄積,勢必破壞必要的細胞成分,最終不可避免地導致細胞凋亡[8]。

本實驗結果顯示,CPR組大鼠在自主循環恢復以后,肺組織出現中至重度的病理損傷,主要表現為部分肺泡壁斷裂,肺泡間隔增寬,肺間質內炎性細胞浸潤,肺泡內充血,肺組織含水量亦明顯增加。由此證明,復蘇后肺損傷的存在。此外,在復蘇以后,CPR組大鼠肺組織MDA含量顯著增加,SOD活性明顯下降,血清炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量均顯著上升,肺組織中磷酸化的NF-κ B P65表達量增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平下降,而凋亡蛋白Bax水平明顯上調,提示肺組織氧化應激損傷加重,出現了一定程度的全身炎癥反應,肺組織內的炎癥反應通路激活,并伴隨有細胞凋亡。所得結果與先前的研究基本一致,而參附注射液治療后,大鼠肺組織病理損傷程度減輕,含水量明顯下降,氧化應激損傷減輕,表明參附注射液對CPR大鼠肺損傷具有一定的保護作用。

從本質上來說，鄉村原生態旅游就是將自然環境作為基礎，在無社會破壞及干擾的情況下，促進鄉村經濟發展，實現我國社會經濟可持續發展。在鄉村旅游事業迅速發展的背景下，我國逐漸加強了對鄉村旅游資源的開發及利用，當地居民的生活用水顯著增加，且污水處理系統缺乏完善性，導致大量的生活污水難以得到及時處理，進而流入自然河流中，對河流湖泊等水環境造成較大的破壞及污染，不僅影響游客旅游過程的體驗，也威脅到我國鄉村原生態旅游環境的可持續發展［1］。

參附注射液已廣泛應用于臨床多年,先前的研究表明,參附注射液可以阻斷炎癥反應的惡性循環,改善全身微循環狀態并延長缺氧耐受時間。在改善心輸出量、組織再灌注及氧代謝,以及降低全身血管阻力、肺動脈壓力及肺毛細血管楔壓方面,參附注射液的作用均優于多巴胺[9]。在感染性休克模型中,參附注射液可下調HMGB1的表達、移位及分泌,進而抑制HMGB1介導的NF-κB通路活化,最終阻斷下游的炎癥因子釋放[10]。在肺缺血再灌注損傷模型中,參附注射液治療可降低大鼠肺組織含水量及支氣管肺泡灌洗液中總蛋白的含量,抑制炎癥反應及肺組織脂質過氧化損傷,發揮一定的肺保護作用[2]。在失血性休克模型、膿毒癥模型及心肺復蘇模型中,參附注射液均可通過抑制細胞凋亡減輕多種器官的損傷[3,11-12]。本實驗觀察到,心肺復蘇過程中,參附注射液治療后,大鼠血清炎癥因子含量顯著下降,磷酸化的NF-κ B表達水平下調,抗凋亡蛋白Bcl-2的表達增加,而凋亡蛋白Bax的表達下降。由此證明,參附注射液對CPR大鼠肺損傷的保護作用與抗炎、抗凋亡作用有關。

綜上所述,本研究表明,在心肺復蘇中,參附注射液治療,可減輕CPR術后肺損傷,其機制可能與抑制炎癥反應及細胞凋亡有關。