宏基因組二代測序在肺結(jié)核診斷中的應(yīng)用

唐小莉 戴廣川 高衛(wèi)衛(wèi) 陳珊珊 曾誼

目前我國每年新發(fā)肺結(jié)核患者約90萬例[1],結(jié)核病仍是我國傳染病死亡主要原因,及早診斷、及時治愈是消除傳染源、控制結(jié)核病流行及降低死亡率的最重要措施。目前的病原學(xué)診斷工具包括抗酸桿菌涂片、微生物培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF(Xpert)、全基因組測序等分子檢測。mNGS是一種新型、快速、簡單、方便的臨床感染性疾病鑒定的檢測方法[2],只需一次運(yùn)行即可無偏倚地獲得所有獲得微生物核酸片段的序列信息,通過分析和比較可鑒定所有微生物物種[3]。在這項(xiàng)研究中,我們回顧性分析91例疑似肺結(jié)核患者BALF的傳統(tǒng)病原體檢測方法與mNGS結(jié)果并進(jìn)行對比,評估m(xù)NGS在肺結(jié)核診斷中的臨床價值。

資料與方法

一、一般資料

收集2020年12月至2021年6月在南京市第二醫(yī)院收治的91例疑似肺結(jié)核患者,從每位患者的BALF中取樣分別送檢mNGS(諾因生物,南京)、涂片、培養(yǎng)、Xpert,參照《肺結(jié)核診斷》(WS 288—2017)[4]以確定最終臨床診斷,包括臨床診斷肺結(jié)核和確診肺結(jié)核。

二、納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn):(1)門診經(jīng)痰涂片初步篩查為陰性的疑似肺結(jié)核患者。(2)臨床資料完整無缺失。(3)臨床樣本和檢測過程通過mNGS的質(zhì)量控制。

排除標(biāo)準(zhǔn):(1)臨床和實(shí)驗(yàn)室資料不完整。(2)診斷不明確。(3)臨床樣本未通過 mNGS 質(zhì)量控制。(4)樣品泄漏和污染。

本研究所有患者均已獲得知情同意書,并通過南京市第二醫(yī)院倫理委員會審批(2021-LY-kt073)。

三、方法

1 標(biāo)本采集:納入患者的BALF。2 常規(guī)檢測方法:涂片按照《結(jié)核分枝桿菌藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》進(jìn)行。培養(yǎng)采用BACTECMGITTM960分枝桿菌快速培養(yǎng)法[5]。Xpert按照利福平耐藥實(shí)時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)儀器使用說明書進(jìn)行操作(美國Cepheid公司),檢測結(jié)果自動判讀。3 mNGS:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序采集納入患者的BALF 1.5～3 mL,儲存無菌凍存管中,24小時內(nèi)進(jìn)行檢測。樣本按照TIANamp Micro DNA Kit(DP316,Tiangen Biotech)試劑盒步驟提取DNA處理產(chǎn)生200～300 bp片段,通過PCR 擴(kuò)增和環(huán)化反應(yīng)產(chǎn)生單鏈環(huán)來構(gòu)建文庫,Agilent 2100 用于質(zhì)量控制,通過 BGISEQ-200平臺對質(zhì)量確認(rèn)的文庫進(jìn)行測序,排除人源序列后的其余數(shù)據(jù)與KnoinDXTM建立的基于NCBI(GenBank/RefSeq/NT)的微生物參考數(shù)據(jù)庫對比進(jìn)行高級數(shù)據(jù)分析。本研究使用的參考數(shù)據(jù)庫包含10216 種細(xì)菌、5875 種病毒、3789 種真菌和432 種寄生蟲。結(jié)核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)陽性mNGS 結(jié)果的閾值標(biāo)準(zhǔn):MTB是一種胞內(nèi)分枝桿菌病原體,核酸提取困難,且BALF污染可能性小,因此當(dāng)至少1個讀數(shù)被映射到種水平時MTB被認(rèn)為是陽性[6]。

四、統(tǒng)計學(xué)分析

非正態(tài)分布的連續(xù)變量表示為中位數(shù)(四分位數(shù)間距),正態(tài)分布的連續(xù)變量表示為均值(標(biāo)準(zhǔn)差),分類變量表示為n(%)。組間差異采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)、卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。以臨床最終診斷為參考標(biāo)準(zhǔn),建立 2×2 列聯(lián)表以確定敏感度、特異度、陽性預(yù)測值 (PPV) 和陰性預(yù)測值 (NPV),結(jié)果以 95% 置信區(qū)間 (CI)表示,mNGS與其他檢測方法的敏感差異性用Mcnemar χ2檢驗(yàn)。使用SPSS 25.0軟件、MedCalc V19.0.7.0軟件和Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。P<0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義,所有檢驗(yàn)均采用雙尾檢驗(yàn)。

結(jié) 果

一、患者基本信息

共有91名患者符合本研究的納入標(biāo)準(zhǔn),男性53例(58.24%),年齡中位數(shù)(四分位區(qū)間)為52.00(28.50,63.00)歲;女性38例(41.76%),年齡均值(標(biāo)準(zhǔn)差)為(51.00±16.88)歲。其中73例 (80.22%) 診斷為肺結(jié)核,男性43例(58.90%),年齡中位數(shù)(四分位區(qū)間)為49.00(26.00,63.00)歲,女性30例(41.10%),年齡均值(標(biāo)準(zhǔn)差)為(51.07±17.62)歲。18例(19.78%)患者診斷為非結(jié)核感染性疾病,男性10例(55.56%),年齡均值(標(biāo)準(zhǔn)差)為(55.40±17.43)歲,女性8例(44.44%),年齡均值(標(biāo)準(zhǔn)差)為(50.75±14.84)歲。兩組患者的年齡、性別、實(shí)驗(yàn)室參數(shù)、癥狀等方面均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。

二、不同檢測手段在肺結(jié)核診斷中的效能

在73例肺結(jié)核患者中,mNGS共檢出MTB陽性28例。mNGS與涂片、培養(yǎng)、Xpert檢出均陽性的病例僅1例;mNGS與涂片均陽性為9例、與培養(yǎng)均陽性為6例、與Xpert均陽性為17例;僅mNGS陽性為9例,僅涂片陽性為1例,僅Xpert陽性為12例。mNGS診斷肺結(jié)核的敏感度和特異度分別為38.36%(95%CI0.272～0.505)和100.00%(95%CI0.815～1.000),PPV和NPV分別為100.00% (95%CI0.877～1.000)和28.57% (95%CI0.179～0.413);涂片法的敏感度和特異度分別為15.07%(95%CI0.078～0.254)和77.78%(95%CI0.524～0.936);培養(yǎng)法的敏感度和特異度分別為10.96%(95%CI0.049～0.205)和100.00%(95%CI0.815～1.000);Xpert的敏感度和特異度分別為41.10%(95%CI0.297～0.532)和94.44%(95%CI0.729～0.999)。本組研究結(jié)果示mNGS敏感度略低于Xpert,兩者之間無顯著性差異(38.36%vs41.10%,P=0.84;);與涂片和培養(yǎng)相比,mNGS的敏感度分別增加(38.36%vs15.07%;P<0.001),(38.36%vs10.96%;P<0.001),其P值均<0.001,兩者之間存在顯著性差異。將Xpert和mNGS兩種快速診斷方法結(jié)合起來,發(fā)現(xiàn)可有效提高肺結(jié)核檢測的敏感度,其敏感度可達(dá)56.16% (95%CI0.441～0.678),聯(lián)合診斷效能優(yōu)于四種方法中的任何一種(表1)。

表1 mNGS與涂片法、MTB培養(yǎng)、Xpert在肺結(jié)核診斷中的比較(%)

三、不同檢測手段在肺結(jié)核復(fù)診患者中的診斷效能

將所有納入的91例疑似肺結(jié)核病患者根據(jù)有無抗結(jié)核治療史分為初診病例和復(fù)診病例兩組。與初診病例相比,復(fù)診病例組的涂片(20.00%vs7.14%,P=0.07)和mNGS(57.14%vs42.86%,P=0.19)檢測敏感度提高,培養(yǎng)(14.29%vs16.07%,P=0.82)和Xpert(22.86%vs39.29%,P=0.11)檢測敏感度降低,但均無顯著性差異。其復(fù)診病例中,mNGS的敏感度為57.14%,涂片的敏感度為20.00%,培養(yǎng)的敏感度為14.29%,Xpert的敏感度為22.86%。mNGS與涂片(57.14%vs20.00%,P<0.001)、培養(yǎng)(57.14%vs14.29%,P<0.001)、Xpert(57.14%vs22.86%,P<0.001)之間的敏感度對比均有顯著性差異(表2)。

表2 mNGS與涂片、MTB培養(yǎng)、Xpert在初診與復(fù)診病例中的敏感度比較[n(%)]

四、不同檢測手段對不同抗結(jié)核治療時間復(fù)診患者的診斷效能

在35例復(fù)診患者中,根據(jù)患者抗結(jié)核治療是否超過6個月分為兩組。抗結(jié)核治療時間 ≤ 6個月的患者中,mNGS敏感度分別與涂片(61.54%vs38.46%,P=0.38)、培養(yǎng)(61.54%vs23.08%,P=0.18)、Xpert(61.54%vs53.85%,P=1.00)均未有顯著性差異,且mNGS與涂片、培養(yǎng)、Xpert的聯(lián)合診斷敏感度相當(dāng)(61.54vs76.92%,P=0.63);但在抗結(jié)核治療時間 >6個月的患者中,mNGS的敏感度為54.55%,涂片的敏感度為9.09%,培養(yǎng)的敏感度為9.09%,Xpert的敏感度為4.55%,涂片、培養(yǎng)、Xpert的聯(lián)合診斷敏感度為22.73%。mNGS敏感度與涂片(54.55%vs9.09%,P<0.001)、培養(yǎng)(54.55%vs9.09,P<0.001)、Xpert(54.55%vs4.55,P<0.001)的P值均<0.001,兩者之間均有顯著性差異,且mNGS敏感度大于涂片、培養(yǎng)、Xpert的聯(lián)合診斷(54.55%vs22.73%,P=0.07)。而且,在抗結(jié)核治療時間≤6個月的患者中,MTB與其他病原體混合感染占比15.38%(2/13);非結(jié)核感染患者占比15.38%(2/13),培養(yǎng)和mNGS各檢出1例致病菌;在抗結(jié)核治療時間>6個月的患者中,MTB與其他病原體混合感染占比27.27%(6/22);非結(jié)核感染患者占比36.36%(8/22),mNGS均檢出非結(jié)核感染患者的致病菌,涂片與Xpert均未檢出,培養(yǎng)僅檢出2例(表3)。

表3 mNGS與涂片、MTB培養(yǎng)、Xpert在不同抗結(jié)核治療時間復(fù)診病例中的敏感度比較[n(%)]

五、mNGS對肺結(jié)核合并混合感染的診斷效能

在73例肺結(jié)核患者中,mNGS結(jié)合常規(guī)檢查方法共診斷出混合感染18例(24.66%)。7例為MTB和真菌混合感染(黑曲霉1例、隱球菌1例、白色念珠菌1例、土曲霉2例、煙曲霉2例),3例為MTB和常見細(xì)菌混合感染(副流感嗜血桿菌1例、肺炎克雷伯桿菌1例、巴西奴卡菌1例),5例為MTB和非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacterium,NTM)混合感染(鳥分枝桿菌2例、胞內(nèi)分枝桿菌1例、龜分枝桿菌2例),2例為MTB和病毒混合感染(人皰疹病毒1例、戊肝病毒1例),1例為MTB和真菌、病毒混合感染(出芽短梗霉、人皰疹病毒)。混合感染患者中,除MTB外其它病原體均由mNGS檢出。其中6名患者(6/18,33.33%)僅使用mNGS方法同時檢測出MTB、真菌和NTM(隱球菌、白色念珠菌各1例,鳥分枝桿菌2例、胞內(nèi)分枝桿菌1例、龜分枝桿菌1例)。整體而言,與常規(guī)培養(yǎng)和Xpert相比,mNGS在鑒定混合感染、NTM菌種以及真菌、病毒檢測方面具有明顯優(yōu)勢。

討 論

目前,傳統(tǒng)病原微生物檢測方法在臨床肺結(jié)核病的診斷中仍在廣泛應(yīng)用,但在敏感度、特異度、時效性及信息量等方面存在一定的局限性,尤其對未知或罕見病原體無法進(jìn)行快速識別。其中抗酸染色涂片法僅能提示分枝桿菌感染,其靈敏度僅30%,且無法對MTB與NTM進(jìn)行判別。MTB培養(yǎng)法雖敏感性有所提高,但需2～6周才能提供檢測結(jié)果。Xpert通過rpoB基因互補(bǔ)的探針雖然在2小時內(nèi)能同時識別MTB和利福平(RIF)耐藥性[7],但無法檢測NTM及進(jìn)行菌種鑒定。本研究結(jié)果顯示mNGS與涂片、MTB培養(yǎng)相比,在肺結(jié)核診斷中敏感度具有顯著性差異(38.36%vs15.07%;P<0.01;38.36%vs10.96%,P<0.01),這與之前的研究一致[8-9];與Xpert相比,其敏感性略低,但兩者之間無顯著性差異(38.36%vs41.10%,P=0.84)。將Xpert和mNGS聯(lián)合診斷進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)表明有效提高結(jié)核病檢測的敏感度。在時效性方面mNGS周轉(zhuǎn)時間為24小時,長于Xpert 2小時,明顯短于MTB培養(yǎng),與涂片時間相當(dāng)。整體而言,在肺結(jié)核的早期診斷中mNGS較傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法具有一定優(yōu)勢,尤其與Xpert聯(lián)合診斷時敏感度更高。

本研究結(jié)果顯示mNGS有助于肺結(jié)核患者的混合病原體診斷及非結(jié)核患者的其他病原體診斷,與之前mNGS對混合肺部病原體檢測具有比常規(guī)檢測更高的靈敏度[10-11]的相關(guān)報道相符。病毒檢測常需臨床醫(yī)生預(yù)判并進(jìn)行相關(guān)血清免疫學(xué)及PCR核酸檢測[12]進(jìn)行診斷,在本研究中發(fā)現(xiàn)的兩例病毒感染僅通過mNGS得到鑒定,本結(jié)果進(jìn)一步突出mNGS在識別單個標(biāo)本中致病病原體方面的優(yōu)勢,本組標(biāo)本尤其在鑒定NTM菌種、真菌與病毒方面具有優(yōu)越的可行性,與mNGS在結(jié)核、真菌、病毒診斷方面比傳統(tǒng)培養(yǎng)更有優(yōu)勢[6]。機(jī)體被結(jié)核感染后細(xì)胞免疫功能受損易繼發(fā)NTM、真菌(曲霉、肺孢子菌、隱球菌等)、病毒(巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、呼吸道合胞病毒等)、軍團(tuán)菌、諾卡菌等感染[13],鑒于相關(guān)致病菌核酸提取率低,故在無菌操作獲取的BALF標(biāo)本中檢測出的上述病原體盡管序列數(shù)低仍需考慮其致病可能[14],且由于抗菌藥物使用對mNGS的影響小于傳統(tǒng)培養(yǎng),故建議根據(jù)檢測結(jié)果可以進(jìn)行抗菌藥物治療方案的調(diào)整[6]。文獻(xiàn)報道肺結(jié)核死亡的主要原因中肺結(jié)核合并感染死亡率最高[15]。mNGS可以早期發(fā)現(xiàn)可能致病病原體,指導(dǎo)抗菌藥物的精準(zhǔn)選擇,從而有望降低肺結(jié)核患者的病死率,但尚需要大樣本的研究證實(shí)。

由于抗結(jié)核藥物抑制了結(jié)核菌的生長,故有結(jié)核藥物治療史的患者常規(guī)涂片、培養(yǎng)法MTB陽性檢出率較無治療史者降低,而mNGS檢出MTB陽性率無顯著差異[16]。我們根據(jù)患者有無抗結(jié)核治療史將所納入患者分為初診病例和復(fù)診病例兩組,我們的結(jié)果也表明,mNGS檢出效率不受之前使用抗結(jié)核藥物的影響(57.14%vs42.86%,P=0.19)。在復(fù)診病例中,除mNGS與涂片、培養(yǎng)的檢測效率均有顯著性差異外,mNGS與Xpert也存在顯著性差異(57.14%vs22.86%,P<0.01),我們數(shù)據(jù)表明mNGS可有效提高復(fù)診病例的診斷效率。在復(fù)診病例的基礎(chǔ)上,根據(jù)患者抗結(jié)核治療時間是否超過6個月進(jìn)一步分為兩組。發(fā)現(xiàn)在抗結(jié)核治療時間≤ 6個月患者中,各檢查方法敏感度相當(dāng),而在>6個月的患者中mNGS敏感度均大于涂片、培養(yǎng)、Xpert及三者的聯(lián)合檢測,同時非結(jié)核感染患者(36.36%vs15.38%)及MTB與其他病原體混合感染患者(27.27%vs15.38%)占比均高于與對照組,提示規(guī)范抗結(jié)核治療后MTB被有效扼殺,同時因結(jié)核感染后肺部結(jié)構(gòu)改變,局部廓清功能及免疫功能下降易繼發(fā)混合感染。數(shù)據(jù)表明mNGS可有效提高復(fù)診病例的診斷效率,評估是否復(fù)發(fā),為復(fù)診患者及時精準(zhǔn)診治提供了一種可能,且可能更適用于抗結(jié)核治療時間>6個月的復(fù)診患者,避免了非活動性肺結(jié)核患者的過度治療,同時可成為復(fù)診患者分診指標(biāo),以決定患者是否能入住非結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)療機(jī)構(gòu)就醫(yī)。

綜上所述,mNGS在肺結(jié)核早期診斷中敏感度優(yōu)于涂片法、培養(yǎng)法,與Xpert檢測相當(dāng),與Xpert聯(lián)合診斷敏感度更高;在肺結(jié)核合并混合感染方面具有優(yōu)勢;可用于肺結(jié)核復(fù)診患者評估是否復(fù)發(fā),值得推廣應(yīng)用。在這項(xiàng)回顧性研究仍有許多局限性。首先,由于樣本量小,有部分結(jié)果表明了一定的趨勢,但沒有達(dá)到差異顯著性。因此,未來需要納入更多的患者進(jìn)行研究。其次,本研究只進(jìn)行了mNGS DNA檢測,未進(jìn)行 RNA 測序;因此有可能遺漏一些RNA病毒。最后,mNGS目前尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)來確定檢測到的病原微生物是否來自感染、定植或污染,故結(jié)果需與臨床相結(jié)合。