HDAC6調(diào)控在膿毒癥致急性呼吸窘迫綜合征中的研究進展

王萌 陳乾 李華

膿毒癥是感染引起的宿主反應(yīng)失調(diào),進而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙的臨床綜合征,肺臟是最易受損的靶器官之一[1]。膿毒癥發(fā)生時,肺泡毛細血管膜通透性增加,炎癥細胞浸潤,形成嚴重肺水腫,最終導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)[2],而肺血管內(nèi)皮細胞(pulmonary vascular endothelial cell,PVEC)是最早受損且損傷最嚴重的靶細胞[3]。ARDS全球發(fā)病率高,每年超過三百萬,且死亡率居高不下(34.9%～46.1%)[4-5]。近年來,越來越多的研究表明組蛋白乙酰化可通過炎癥抑制、細胞調(diào)控在ARDS中發(fā)揮保護性作用[6]。組蛋白乙酰化的狀態(tài)受組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone acetyltransferases,HAT)和組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)的共同調(diào)節(jié)[7]。其中,HDAC6是HDAC家族中最大的蛋白質(zhì),且可通過調(diào)控非組蛋白底物及信號通路在細胞中發(fā)揮作用。本文就HDAC6在ARDS中的研究進展簡述如下。

一、膿毒癥致ARDS的病理機制

首先,許多研究表明膿毒癥中的早期氧化應(yīng)激和過度的炎癥反應(yīng)是ARDS的關(guān)鍵。膿毒癥期間刺激原激活P38絲裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases,P38 MAPK)、細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子 κB(NF-κB)等炎癥通路,大量炎性細胞和細胞因子聚集,從而導(dǎo)致肺毛細血管內(nèi)皮細胞和肺泡上皮細胞受損,肺泡毛細血管膜通透性增加,形成肺水腫[7-8]。活性氧(reactive oxygen species,ROS)是細胞有氧呼吸的代謝產(chǎn)物,當體內(nèi)活性氧生成過度,氧化應(yīng)激增強,ROS可以與多種細胞因子相互作用,促進促炎細胞因子和粘附分子如ICAM-1/VCAM-1的表達,從而促進炎癥級聯(lián)反應(yīng)的形成。同時,在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的ARDS動物模型中伴有NO、iNOS、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)和白細胞介素-1β (IL-1β)等主要炎癥介質(zhì)的增加[9-10],也同樣證明全身炎癥反應(yīng)失調(diào)是導(dǎo)致膿毒癥所致ARDS的病理基礎(chǔ)。其次,關(guān)于膿毒癥致ARDS的另一主要病理基礎(chǔ)是PVEC過度凋亡,造成肺血管內(nèi)皮損傷。PVEC是幫助保持肺組織完整的重要屏障[11],其分泌的多種介質(zhì)(TNF,VEGF,ET-1,PGI-2,NO等)可激活炎癥反應(yīng)、加速EC膜表達黏附分子、增強促凝血途徑、還可以造成肺泡-毛細血管屏障的改變[12]。通過以上途徑引發(fā)肺實質(zhì)的損傷,出現(xiàn)不可逆的急性呼吸窘迫綜合征。在ARDS患者的肺部超微結(jié)構(gòu)中可觀察到內(nèi)皮細胞的凋亡和壞死[13]。

二、組蛋白乙酰化概述

HAT和HDAC在氣道中廣泛表達,它們分別調(diào)節(jié)組蛋白乙酰化和去乙酰化[14]。一般情況下,HAT與HDAC處于動態(tài)平衡中,一旦失衡,將會促進炎癥、腫瘤、代謝紊亂等多種疾病的發(fā)展[15-16]。脫氧核糖核酸和組蛋白是染色質(zhì)的主要組成部分,染色質(zhì)的緊密結(jié)構(gòu)是靠正負電荷的互相吸引。組蛋白乙酰化發(fā)生時,HAT將乙酰輔酶A(CoA)的乙酰基轉(zhuǎn)移到組蛋白N端賴氨酸殘基上,帶負電荷的乙酰基與帶正電荷的賴氨酸殘基互相結(jié)合,造成組蛋白和DNA連接疏松,以增強 DNA的轉(zhuǎn)錄[17-18];與HAT作用相反,HDAC可將賴氨酸殘基上乙酰基去除,促使DNA和組蛋白緊密結(jié)合,導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)致密,從而抑制DNA的轉(zhuǎn)錄。真核生物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)18種HDAC,根據(jù)不同同源基因和結(jié)構(gòu)域被分為4大類:Ⅰ類(與Rpd3同源的HDAC1、2、3和8)、Ⅱ類(與HDA1同源的HDAC 4、5、6、7、9和10)、Ⅲ類 (與SIR2同源的SIR1、2、3、4、5、6和7)和Ⅳ類(HDAC11)[19]。而Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類是Zn2+依賴性脫乙酰化酶。

三、HDAC6與膿毒癥致ARDS

1 HDAC6結(jié)構(gòu)組織和亞細胞定位

HDAC6蛋白由1215個氨基酸組成,是HDACs家族中最大也是最獨特的一員。首先,其定位特殊:絕大部分HDAC酶只定位在細胞核,而HDAC6功能域的核輸出信號(nuclear export signal,NES)和絲氨酸-谷氨酸的四肽基序(SE14)使其也可穩(wěn)定存在于細胞質(zhì)中。并且,當細胞增殖停止時,核定位信號(nuclear localization signal,NLS)將一部分蛋白質(zhì)移位到細胞核中,這使HDAC6具有更強的脫乙酰能力[20]。其次,其結(jié)構(gòu)特殊:HDAC6是唯一含有兩個完整催化結(jié)構(gòu)域(DD1和DD2)的HDACs,并且這兩個同源脫乙酰酶結(jié)構(gòu)域可獨立地對HDAC6蛋白的整體活性起作用。位于羧基末端的鋅指結(jié)構(gòu)域(ZnF-UBP結(jié)構(gòu)域,也稱為BUZ)可與游離泛素以及單體泛素和多聚泛素蛋白高親和力結(jié)合。因此,HDAC6至少在兩種細胞信號通路的交叉點上起作用,包括依賴于DD1和DD2的去乙酰化酶作用和依賴于BUZ的泛素結(jié)合功能(見圖1)[21-22]。

圖1 HDAC6的功能結(jié)構(gòu)域示意圖

2 HDAC6的生理作用

HDAC6可通過催化多種底物的去乙酰化而表現(xiàn)出不同的功能,而在體內(nèi)更傾向于表現(xiàn)為非組蛋白酶活性。DD1和DD2通過將α-tubulin、Cortactin、HSP90、Ku70和過氧化物還原蛋白(peroxiredoxin Ⅰ and Ⅱ,Prx Ⅰ/Ⅱ)等多種非組蛋白酶活性底物脫去酰基而參與細胞的增殖、遷移和死亡、免疫反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄、錯誤折疊蛋白的降解和應(yīng)激反應(yīng)等[23]。這些生理作用主要受細胞骨架動力學的控制,細胞骨架由微管(MT)、中間絲(由纖維蛋白組成)和絲狀肌動蛋白(球狀f-肌動蛋白聚合物或g-肌動蛋白)組成。α-tubulin是第一個被證實的 HDAC6 去乙酰化底物,其可逆的乙酰化水平與MT的穩(wěn)定性和功能密切相關(guān)。例如:HDAC6在哺乳動物細胞中的過表達會導(dǎo)致MT蛋白處于低乙酰化水平,并促進趨化性細胞運動;相反,抑制HDAC6功能會使MT蛋白超乙酰化,抑制成纖維細胞的活力[20]。

肌動蛋白(actin)的聚合和交聯(lián)是由皮質(zhì)肌動蛋白(Cortactin)促進的。Cortactin可在其F-actin結(jié)合重復(fù)序列內(nèi)被p300/CBP相關(guān)因子(PCAF)乙酰化,F-actin的形成促進了自噬體-溶酶體融合和底物降解。因此,HDAC6不僅可調(diào)節(jié)MT細胞骨架,也可調(diào)節(jié)肌動蛋白,而這也是維持血管內(nèi)皮屏障穩(wěn)定的重要組成部分[24-25]。

HDAC6一般通過激活自噬-溶酶體途徑(ALP)的發(fā)生、促進蛋白質(zhì)聚集體的形成、介導(dǎo)分子伴侶HSP90的活化三種途徑參與錯誤折疊蛋白的降解[26-28],蛋白質(zhì)聚集體中的泛素會招募 HDAC6,從而促進依賴Cortactin的F-actin重塑和隨后的自噬體-溶酶體融合[28];此外,HSP90的乙酰化會使分子伴侶的活性喪失從而導(dǎo)致其結(jié)合蛋白質(zhì)被降解。

Ku70是一種可在非同源末端連接 DNA 修復(fù)中結(jié)合 DNA 雙鏈斷裂的核因子,HDAC6調(diào)控其與促凋亡Bax蛋白(Bc1-2相關(guān)X蛋白)相互作用。當Ku70被乙酰化時,它不再與Bax相互作用,Bax隨后激活細胞凋亡。此外,HDAC6還參與PI3K/AKT/ERK信號通路,HDAC6的下調(diào)會抑制AKT和ERK去磷酸化從而抑制細胞增殖與分化,誘導(dǎo)細胞死亡[29]。

HDAC6在調(diào)控H2O2相關(guān)壓力所引起的細胞反應(yīng)中扮演重要角色。HDAC6是氧化還原調(diào)節(jié)蛋白、過氧化還原蛋白Prx Ⅰ和 Prx Ⅱ的特異性脫乙酰酶。當HDAC6被抑制時,乙酰化的 Prxs 聚集,Prx 的乙酰化增加了H2O2還原活性及超氧化物抗性[30]。

因此,HDAC6與上述反應(yīng)途徑蛋白相互作用為它們在疾病病理和生理機制層面上提供了治療靶點。

3 HDAC6抑制可改善膿毒癥致ARDS

目前認為,組蛋白去乙酰化酶抑制劑(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)本質(zhì)上是固有免疫細胞中關(guān)鍵免疫受體表達和抗菌作用的負性調(diào)節(jié)因子,可以降低巨噬細胞對細菌的吞噬和殺傷作用,提高機體對非嚴重感染的易感性。當機體發(fā)生膿毒癥和膿毒癥休克等嚴重感染時,HDACIs 可以保護肺組織細胞免受致命性的炎癥損傷。Tubastatin A 是迄今為止最有效的 HDAC6 抑制劑[31]。HDACIs 對膿毒癥及相關(guān)肺損傷的保護作用可能通過以下途徑實現(xiàn)。

(1)HDAC6抑制可減輕肺部炎癥反應(yīng)

膿毒癥早期的特點是過度的炎癥反應(yīng),導(dǎo)致“細胞因子風暴”。這種細胞因子風暴之后是一段長時間的相對免疫抑制。這兩個階段都會增加膿毒癥的死亡率。炎癥過程始于嗜中性粒細胞的流入,隨后是單核細胞的募集,然后單核細胞分化成炎性巨噬細胞或樹突狀細胞。這些細胞是炎癥部位的關(guān)鍵效應(yīng)細胞,識別并吞噬病原體和壞死細胞以幫助消除感染。中性粒細胞和巨噬細胞的激活同為ARDS 免疫及炎癥反應(yīng)的病理標志。

HDAC6抑制可以阻斷炎癥信號通路并減輕脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性肺部炎癥[32]。Rosenjack等[33]對LPS 誘導(dǎo)膿毒癥小鼠的研究發(fā)現(xiàn),抑制HDAC6后,小鼠肺泡灌洗液中的中性粒細胞百分比顯著降低,且恢復(fù)MT乙酰化、細胞內(nèi)運輸并減少炎癥信號傳導(dǎo)。Zhang L.等[34]通過盲腸結(jié)扎穿孔 (CLP) 誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型發(fā)現(xiàn),與未經(jīng)HDACIs預(yù)處理的空白組小鼠相比,HDACIs組小鼠肺組織的中性粒細胞浸潤減少、血漿 IL-6水平降低、肺泡灌洗液中TNF-α和IL-1β的水平下降,ICAM-1和 E-選擇素的表達顯著減少; CLP 小鼠的存活時間顯著延長,膿毒癥所致肺損傷顯著減輕。Zhang W.B.等[35]研究后發(fā)現(xiàn),HDAC6抑制劑可阻斷 ROS 的過量產(chǎn)生,并抑制LPS 激活的巨噬細胞中促炎細胞因子如 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的表達。核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(Nrf2)在抑制ROS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起重要作用[36]。Nrf2可以調(diào)節(jié)其下游相關(guān)靶基因血紅素氧合酶-1(HO-1)以發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激的作用。此外,HO-1的表達可以抑制促炎細胞因子在巨噬細胞中的產(chǎn)生[37]。Thangavel等[38]發(fā)現(xiàn),在LPS誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠模型早期,組蛋白去乙酰化酶抑制劑(Trichostatin A,TSA)和DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza 2-deoxycytidine,Aza)的聯(lián)合預(yù)處理可減少肺組織炎癥并促進M2型巨噬細胞極化,提高抗炎反應(yīng)。由此可見,與炎性反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子、細胞內(nèi)信號分子、細胞因子受體等均受到乙酰化調(diào)節(jié),因而HDACIs可影響炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展,為膿毒癥致ARDS的治療提供了一條新的途徑。

(2)HDAC6抑制可降低膿毒癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞高滲透性

內(nèi)皮屏障功能障礙是一種血管對炎癥的反應(yīng),會導(dǎo)致血管通透性增加,血管內(nèi)外液體交換失衡,它的功能障礙可導(dǎo)致富蛋白質(zhì)水腫的發(fā)生,常伴隨發(fā)生于ARDS[39]。MT、肌動蛋白細胞骨架和細胞間連接(粘著連接AJ,緊密連接TJ)是維持內(nèi)皮屏障完整性所需的關(guān)鍵成分。MT結(jié)構(gòu)的主要蛋白組成成分為α-和 β-tubulin,HDAC6介導(dǎo)的tubulin去乙酰化會導(dǎo)致MT解聚,穩(wěn)定性降低,而通過抑制HDAC6增強tubulin乙酰化可降低膿毒癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障高通透性[40]。諾考達唑是一種MT去穩(wěn)定劑,可以在肺血管內(nèi)皮細胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生內(nèi)皮細胞屏障功能障礙;而使用MT穩(wěn)定劑紫杉醇的靜脈內(nèi)給藥可改善 EBD 和LPS致肺損傷所產(chǎn)生的炎癥[41]。

此外,MT與肌動蛋白細胞骨架的相互作用在調(diào)節(jié)內(nèi)皮通透性方面也發(fā)揮著積極作用。Rho是MT和肌動蛋白骨架之間的信號傳導(dǎo)中間體,通過抑制HDAC6可下調(diào)Hsp90 依賴性RhoA 活性和信號傳導(dǎo),然后通過抑制肌動蛋白細胞骨架重組和細胞收縮改變內(nèi)皮通透性[42]。

AJ是細胞間連接的重要組成部分,在維持細胞屏障完整性也發(fā)揮著重要作用。VE-cadherin蛋白和β-catenin蛋白是 AJ 復(fù)合物的兩個主要成分。β-catenin 蛋白在細胞-細胞連接處與VE-cadherin相互作用,以支持內(nèi)皮屏障完整性。β-catenin去乙酰化會誘導(dǎo)β-catenin核轉(zhuǎn)位和 AJ 的解聚,而抑制 HDAC6 可恢復(fù) β-catenin 乙酰化來降低膿毒癥誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障高滲透性[43]。

半胱天冬酶(Caspases)的激活在內(nèi)皮細胞屏障功能障礙發(fā)生過程中也起著重要作用。其主要機制包括介導(dǎo)細胞凋亡和改變細胞連接蛋白如ZO-1和VE-cadherin排序。MT破壞會導(dǎo)致凋亡信號傳導(dǎo)和Caspases激活增加。抑制Caspases可有效減輕膿毒癥致ARDS小鼠模型的肺部損傷[44]。

目前,有多項研究證明HDAC6抑制可有效減輕肺內(nèi)皮細胞屏障功能障礙。Thangavel等[45]研究表明,在 LPS 誘導(dǎo)的小鼠ARDS模型中,TSA的干預(yù)可降低死亡率并改善肺血管內(nèi)皮細胞的完整性。Joshi等[42]提出HDAC6 抑制劑通過抑制 Hsp90 依賴性 RhoA活性和信號傳導(dǎo),可減輕與 LPS 誘導(dǎo)的小鼠 ARDS 相關(guān)的炎癥、毛細血管通透性和結(jié)構(gòu)異常。Yu等[46]觀察到與對照組相比,用HDAC6抑制劑預(yù)處理組的膿毒癥小鼠肺血管內(nèi)皮細胞連接蛋白表達改善,肺水腫減輕。綜上,HDAC6抑制是一種可以調(diào)節(jié)炎癥性肺損傷中內(nèi)皮細胞連接穩(wěn)定性的新方法。

(3) HDAC調(diào)控miRNA參與膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS

miRNA 是一組進化上保守的小型內(nèi)源性非編碼 RNA,它們通過對其靶轉(zhuǎn)錄物的序列特異性識別來協(xié)調(diào)哺乳動物基因的表達。miRNA 參與許多病理生理過程,例如調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、凋亡、代謝和免疫反應(yīng)。

近年來研究發(fā)現(xiàn),miRNA 與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān),包括肺炎、肺癌、肺纖維化等[47]。在ARDS 中,miRNA 可以通過靶向特定分子來調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)[48-49]。目前與促炎相關(guān)的 miRNA 主要有miR-34a、miR-132、miR-155、miR-15a、miR-21、miR-27b和miR-146a等。膿毒癥合并ARDS患者血漿中miR-155的表達明顯高于膿毒癥但未合并ARDS的患者。膿毒癥合并ARDS患者的miR-155水平與IL-1β和TNF-α水平及ARDS評分呈正相關(guān),與PaO2/FiO2呈負相關(guān)[50]。Jiang等發(fā)現(xiàn)miR-23a-3p升高促進LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細胞M1極化,而抑制miR-23a-3p會導(dǎo)致巨噬細胞反應(yīng)降低并改善肺部炎癥[51]。越來越多的證據(jù)表明,miRNA 在與血管生物學功能相關(guān)的多個生物學過程中發(fā)揮著重要作用,例如血管生成、內(nèi)皮細胞功能和血管炎癥[52]。此外,Xu等[53]從小鼠骨髓基質(zhì)干細胞 (BMSCs) 中分離出外泌體,使用LPS建立小鼠肺部炎癥模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn)外泌體和miR-150減輕了炎癥和肺水腫,同時保持了肺泡結(jié)構(gòu)的完整性;它們還可通過調(diào)節(jié)caspase-3、Bax/Bcl-2和MAPK信號傳導(dǎo)來減輕微血管內(nèi)皮細胞損傷。小細胞外囊泡(sEV)治療會抑制肺血管內(nèi)皮細胞凋亡,Li等[54]發(fā)現(xiàn)不止一種miRNA在調(diào)節(jié)sEV減輕 LPS 誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障損傷方面發(fā)揮作用。

HDAC6與 miRNA 關(guān)系密切。Wildung 等[55]通過建立小鼠ARDS模型觀察纖毛相關(guān)基因與 miR449-/-表達變化的研究發(fā)現(xiàn),用HDAC6 抑制劑處理的miR449-/-細胞具有更多和更長的呼吸纖毛,提示 HDACIs 可影響 miRNA 的表達。Li等[56]研究表明,Tubacin可增強DNM3os/miR-199a2 軸的表達,具有降低缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)和肺血管內(nèi)皮細胞中的內(nèi)皮素-l(ET-l)水平的有益結(jié)果。所以,HDAC6所調(diào)節(jié)的miRNA可能是ARDS 的診斷指標和治療靶點。

四、小結(jié)

ARDS是膿毒癥的常見臨床并發(fā)癥,極大地危害著人類健康,在過去十年中,膿毒癥療法的開發(fā)取得了一定進展,但死亡率仍然很高。因此,研究包括膿毒癥分子機制在內(nèi)的發(fā)病機制對于設(shè)計膿毒癥預(yù)防和治療策略具有重要意義。HDAC6抑制主要通過抑制炎癥信號通道,減少炎癥因子的釋放來改善膿毒癥誘導(dǎo)的ARDS;HDAC6抑制還通過誘導(dǎo)α-tubulin和β-catenin乙酰化、增加β-catenin的膜定位,對其靶底物的影響來保護內(nèi)皮屏障功能,從而導(dǎo)致MT和AJs的穩(wěn)定;它還可以防止caspase-3活化,維持肺內(nèi)皮細胞-細胞連接,抑制肌動蛋白應(yīng)力纖維形成,并通過調(diào)節(jié)HSP90降低肌球蛋白輕鏈的磷酸化。此外,許多研究表明增加保護性miRNA的表達和抑制不利的miRNA可有效緩解ARDS,一些miRNA還被證明是ARDS的生物標志物。而HDACIs可通過miRNAs發(fā)揮其抗炎及抗凋亡作用。這些發(fā)現(xiàn)均支持HDAC6抑制是一種預(yù)防器官衰竭和改善膿毒癥預(yù)后的新型治療靶點。