中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)在慢性阻塞性肺疾病中的研究進(jìn)展

崔旭東 道日娜 楊敬平 徐喜媛 孫麗

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種異質(zhì)性肺部狀態(tài),以慢性呼吸道癥狀為特征,氣道異常和/或肺泡異常導(dǎo)致的持續(xù)性氣流阻塞[1],是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均高的慢性疾病。全球≥40歲人群中COPD患病率達(dá)到9%～10%,死因處于第3位[2]。2019年我國死因監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示[3],在我國居民十大死因中,COPD占全因死亡的10.6%,居第4位。故尋求一種COPD新的診斷工具和治療策略就變得極具意義。近年研究發(fā)現(xiàn)將近80%的COPD患者痰液中含有NETs,而且急性加重期的COPD患者痰液中NETs的豐度要明顯高于輕度患者[4]。NETs可通過其組分的細(xì)胞毒性及促炎作用參與其相關(guān)的慢性肺部疾病的發(fā)生發(fā)展。最新研究發(fā)現(xiàn)[5],NETs能夠激活METTL3介導(dǎo)的m6A修飾以誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡,調(diào)節(jié)膿毒血癥相關(guān)性急性肺損傷。本綜述針對(duì)NETs在COPD發(fā)生發(fā)展及治療等方面進(jìn)行闡述。

一、NETs的產(chǎn)生與功能

NETs最早由布林克曼等發(fā)現(xiàn),當(dāng)中性粒細(xì)胞受到脂多糖(LPS)或IL-8的刺激后,會(huì)產(chǎn)生一種由直徑15～17 nm的纖維網(wǎng)和直徑25 nm左右的球狀結(jié)構(gòu)域組成的胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。該結(jié)構(gòu)主要以胞外DNA為骨架,多種活性蛋白鑲嵌其中,包括中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(NE)、組織蛋白酶G(Cath G)和髓過氧化物酶(MPO)[6]。NETs通過一種稱為“NETosis”的獨(dú)特的細(xì)胞死亡形式響應(yīng)特定的刺激后而形成,它在先天性免疫中發(fā)揮著獨(dú)特的作用,與凋亡、壞死等方式完全不同,是一種活躍的細(xì)胞死亡形式,主要途徑為NADPH氧化酶( Nox2 )依賴性和Nox2非依賴性,二者在機(jī)體防御中協(xié)同發(fā)揮作用。其中與COPD密切相關(guān)的是NADPH氧化酶( Nox2 )依賴途徑。在感染的刺激下,LPS等物質(zhì)可通過與細(xì)胞膜TLR4受體結(jié)合,激活PKC-Raf-MEK-ERK通路,激活Nox2,刺激活性氧(ROS)的產(chǎn)生,從而活化大量存在于胞漿中的肽酰基精氨酸脫亞胺酶 4 (PAD4)進(jìn)而促進(jìn)胞漿噬天青顆粒釋放MPO、NE轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核切除組蛋白N端尾部,減弱結(jié)合能力,協(xié)助染色質(zhì)的解聚過程。此外,活化PAD4可通過誘導(dǎo)組蛋白的精氨酸側(cè)鏈過度瓜氨酸化,表面正電荷的消失,減弱結(jié)合能力,染色質(zhì)解聚。最終核膜及細(xì)胞膜在ROS、MPO及NE等物質(zhì)的作用下破裂,NETs釋放。NETs具有抵抗感染、限制細(xì)菌遠(yuǎn)處傳播的作用,是抵抗入侵微生物的有效機(jī)制。但其在殺菌防御和宿主組織損傷之間的平衡作用并不明確。研究表明[5],NETs誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞鐵死亡,調(diào)節(jié)膿毒血癥相關(guān)性急性肺損傷,還參與慢性肺部疾病的發(fā)生發(fā)展,如肺囊性纖維化[7]、哮喘[8]和細(xì)菌性肺炎[9]。

二、NETs在COPD發(fā)病中的作用

COPD的病因主要是吸煙和吸入來自家庭、室外空氣污染的有毒顆粒和氣體,但其他環(huán)境和宿主因素也可能起作用[10]。慢性氣道炎癥、氣道黏液高分泌所致持續(xù)氣流受限及肺氣腫形成是 COPD 的主要病理生理改變;肺動(dòng)脈高壓所致慢性肺源性心臟病是COPD的常見并發(fā)癥;細(xì)菌感染是AECOPD的主要原因。NETs參與上述COPD發(fā)生、發(fā)展過程。

1 NETs在COPD 病因中的作用

研究發(fā)現(xiàn),煙草作為COPD最常見的病因,其提取物 CSE可通過Nox2依賴的方式誘導(dǎo)NETs形成[11]。其他相關(guān)環(huán)境因素如交通相關(guān)污染(TRAP)、有毒重金屬鎘( Cd )的暴露同樣被證明可以刺激NETs的形成[12-13]。Wooding等研究了從不吸煙者、曾經(jīng)吸煙健康者和輕中度COPD患者,暴露于柴油車尾氣和過濾空氣,發(fā)現(xiàn)可明顯增加柴油車尾氣受試者NETs的數(shù)量。Cd通過激活ERK、MEK信號(hào)通路和Nox2誘導(dǎo)NETs形成[12]。此外,NETs通過自身正反饋調(diào)節(jié)及清除減少,導(dǎo)致在COPD患者肺部過度累積,參與COPD發(fā)病。研究表明:NETs 本身可通過組蛋白,在Th17細(xì)胞促進(jìn)因子的存在下,直接作用于T細(xì)胞TLR2,誘導(dǎo)STAT3的磷酸化,促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化,導(dǎo)致 IL-17的產(chǎn)生增加,驅(qū)動(dòng)前饋回路,參與了NETs在COPD患者肺部的過度累積[14]。在生理?xiàng)l件下,肺部組織的NETs一般可以通過內(nèi)源性核酸酶、巨噬細(xì)胞進(jìn)行清除來維持平衡避免其損傷效應(yīng)。Kylie等研究人員認(rèn)為,COPD患者中肺泡巨噬細(xì)胞數(shù)量稀少,吞噬作用缺陷[15],導(dǎo)致NETs清除減少。研究表明:Cath G能通過分解肺表面活性劑蛋白D(SP-D),抑制SP-D與NETs 的結(jié)合,減弱兩者之間的相互作用,進(jìn)一步抑制肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)NETs的清除作用[16]。

2 NETs在COPD 慢性氣道炎癥中的作用

NETs作為內(nèi)源性損傷相關(guān)分子模式,不僅可誘導(dǎo)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-1b、IL-1a和IL-6誘導(dǎo)炎癥,還可通過TLR4、NF-κB信號(hào)通路在炎癥和粘液高分泌中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[17]。研究發(fā)現(xiàn)[18],過量 Cath G 活化促使 IL-8、TNF-α和IFN-γ等促炎細(xì)胞因子的積累聚集,造成ROS大量增加,誘導(dǎo)杯狀細(xì)胞脫顆粒,損傷肺組織。NE作為NETs相關(guān)宿主免疫防御中的關(guān)鍵一環(huán),可直接消化抗炎分子顆粒蛋白前體(PGRN)并通過其產(chǎn)物GRN肽( GRN-B )誘導(dǎo)IL-8的表達(dá)[19]。如此形成炎癥的惡性循環(huán),引起呼吸爆發(fā),ROS大量積累,進(jìn)而導(dǎo)致氣道上皮損傷及肺泡血管內(nèi)皮功能障礙,機(jī)體的免疫失衡,導(dǎo)致COPD的發(fā)生發(fā)展。

3 NETs在COPD 氣道粘液高分泌及肺氣腫形成中的作用

氣道黏液高分泌是 COPD 發(fā)生發(fā)展中的重要因素,哥本哈根心臟研究中心通過為期10年的訪視發(fā)現(xiàn),慢性黏液高分泌人群肺部感染風(fēng)險(xiǎn)增加、死亡率增高[20]。NETs可通過結(jié)合氣道上皮細(xì)胞受體誘導(dǎo)或刺激巨噬細(xì)胞釋放IL-1β,促進(jìn) MUC5AC基因高表達(dá)[21],導(dǎo)致氣道高分泌。NE和Cath G作為氣道杯狀細(xì)胞的促分泌劑[22]可與作為痰液成分的胞外DNA進(jìn)一步增加粘液粘稠度,氣道阻塞,持續(xù)性氣流受限。Cath G可分解肺表面活性物質(zhì)蛋白SP-D,促進(jìn)小鼠肺組織中ROS水平升高,激活基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的產(chǎn)生,降解肺泡壁膠原纖維、彈性纖維等成分,引起肺泡壁塌陷或形成大皰從而導(dǎo)致肺氣腫[23-24]。組蛋白可以通過干擾Ca21穩(wěn)態(tài)和線粒體毒性機(jī)制,對(duì)氣道上皮等肺細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生直接的細(xì)胞毒性作用,進(jìn)而參與COPD的發(fā)生發(fā)展[25]。

4 NETs在COPD導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓中的作用

肺動(dòng)脈高壓作為COPD的常見并發(fā)癥,主要由低氧血癥引起,可導(dǎo)致患者臟器受損,增加再入院風(fēng)險(xiǎn),是 AECOPD 患者預(yù)后不良及死亡的重要原因。肺動(dòng)脈高壓的病因復(fù)雜,包括內(nèi)皮功能障礙、原位血栓的形成及內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的重塑和增殖。NETs不僅可以為紅細(xì)胞的黏附和血小板的距離提供支架,還能增強(qiáng)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和MMP-9的分泌并協(xié)同VEGF刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖[26],還可以通過TLR2介導(dǎo)的組蛋白對(duì)血小板的活化作用,驅(qū)動(dòng)血漿凝血酶的產(chǎn)生[27],進(jìn)而參與血栓的形成及肺部血管重塑,促使生理性無效腔的增大,通氣與血流比例失調(diào),肺泡及毛細(xì)血管的大量喪失,彌散面積減少,導(dǎo)致?lián)Q氣功能障礙,進(jìn)一步加重病情。

5 NETs在COPD患者細(xì)菌定植及耐藥性中的作用

細(xì)菌感染是 AECOPD的主要原因,30%～70%的 AECOPD與細(xì)菌感染密切相關(guān)[28]。此外,肺部感染還是COPD患者最嚴(yán)重的并發(fā)癥,是患者病死的主要因素。J.Ekl?f等通過對(duì)2010年1月1日至2017年10月31日就診的22053例COPD門診患者隨訪,發(fā)現(xiàn)合并銅綠假單胞菌感染的AECOPD患者死亡的風(fēng)險(xiǎn)將會(huì)顯著增加[29]。而胞外DNA作為NETs的抗菌成分[30],當(dāng)細(xì)菌入侵或慢性定植于氣道時(shí),胞外DNA可通過螯合和去除細(xì)菌外膜中的二價(jià)陽離子,造成膜擾動(dòng)和細(xì)胞裂解進(jìn)而發(fā)揮抗菌活性。但研究表明COPD患者痰中分離出銅綠假單胞菌具有極高的突變率和抗生素耐藥性[31]。亞抑菌濃度下的胞外DNA能夠誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥性的形成[32]。亞抑菌濃度DNA可通過創(chuàng)造陽離子限制環(huán)境,誘導(dǎo)銅綠假單胞菌中Pho PQ和Pmr AB調(diào)控的陽離子抗菌肽耐藥操縱子PA3552-PA3559表達(dá)上調(diào),最終可能導(dǎo)致細(xì)菌的長期定植及耐藥性的形成,參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

三、NETs在COPD治療中的作用

因此以NETs的形成及相關(guān)組成成分作為靶點(diǎn)的研究,對(duì)探索COPD疾病的治療和特異性靶向藥物的開發(fā)具有極其重要的意義。

1 Nox2/PAD4抑制劑

PAD4作為NETs產(chǎn)生與釋放的過程中不可或缺的角色,BB-Cl-脒作為PAD4特異性抑制劑可阻斷吸煙誘導(dǎo)的NETs的產(chǎn)生。研究表明,PAD4抑制劑已被證明可以明顯減輕NETs相關(guān)炎性效應(yīng),減少炎癥細(xì)胞浸潤,改善內(nèi)皮依賴性血管舒張,保護(hù)臟器,延緩病情進(jìn)展[5]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素還具有調(diào)節(jié)NETs釋放的作用。國外學(xué)者發(fā)現(xiàn),在小鼠模型中,紅霉素可通過對(duì)Nox2抑制的作用,減少氣道NETs,進(jìn)而減輕NETs相關(guān) Th17的產(chǎn)生與分化,減輕實(shí)驗(yàn)性肺氣腫小鼠模型的肺部炎癥[33]。后續(xù)的體外實(shí)驗(yàn)更是進(jìn)一步證明,紅霉素在體外對(duì)CSE誘導(dǎo)的NETs相關(guān)NE及MPO也表現(xiàn)了較好的抑制作用。其他抗生素如頭孢噻肟,就對(duì)這個(gè)過程沒有影響。此外,羅紅霉素還可顯著減弱MUC5AC表達(dá)和NF-κB核易位,以緩解NETs誘導(dǎo)的肺部炎癥反應(yīng)及氣道粘液分泌過多[34]。還有學(xué)者認(rèn)為茶提取物(CLE)給藥也可以作為一種預(yù)防或治療CSE誘導(dǎo)的COPD新的治療策略。CLE可以抑制PMA誘導(dǎo)的HL-60細(xì)胞內(nèi)ROS,進(jìn)而抑制NETs的產(chǎn)生[35]。因此,Nox2/PAD4抑制劑在避免NETs在COPD患者中過度累積中具有一定的治療前景。但其具體的臨床應(yīng)用效用仍待進(jìn)一步的探索,這可能會(huì)是未來靶向治療的新方向。

2 脫氧核糖核酸酶

DNase作為一種核酸內(nèi)切酶,不僅可以催化NETs中胞外DNA的降解,以避免NETs相關(guān)細(xì)菌耐藥的形成、改善氣道粘液粘稠度,還可以降低了NETs相關(guān)MUC5AC高表達(dá)、減少了誘導(dǎo)的杯狀細(xì)胞化生并通過降低IL-1β、IL-6和TNF-α水平改善氣道內(nèi)炎性細(xì)胞的浸潤。在小鼠模型中[36],這些都已得到了有效的驗(yàn)證,霧化吸入DNase減輕的小鼠氣道炎癥和黏液分泌過多的有效性,而且學(xué)者們還將其與TLR4/NF-κB信號(hào)通路聯(lián)系了起來,這可能是COPD未來治療的新方向。雖然DNase的治療效用在相關(guān)小鼠模型得到了一定驗(yàn)證。但是后續(xù)研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌刺激下釋放的NETs,在使用DNase治療后,會(huì)造成肺組織損傷,進(jìn)一步加重病情[37]。這可能與NETs降解造成的蛋白酶釋放和活性增加有關(guān)。

3 蛋白酶抑制劑

蛋白酶抑制劑可直接抑制NE、Cath G等蛋白酶活性,減少其在炎癥部位附近的組織潛在的擴(kuò)散和誘導(dǎo)損傷。西維來司鈉作為小分子NE抑制劑,可選擇性抑制彈性蛋白酶,抑制IL-8等炎性因子釋放及氣道黏液高分泌。Wang K.[38]等的研究發(fā)現(xiàn),抑制NE可阻斷中性粒細(xì)胞中的NE核易位和染色質(zhì)解聚來預(yù)防CSE誘導(dǎo)NETs形成,進(jìn)而消除CSE誘導(dǎo)NETs相關(guān)ROS產(chǎn)生和中性粒細(xì)胞的遷移損傷,減輕COPD患者的氣道炎癥,同時(shí)干擾NETs與杯狀細(xì)胞相互作用,抑制粘液分泌杯狀細(xì)胞增生和肺氣腫樣肺泡破壞的改變等關(guān)鍵病理變化,改善肺功能。

4 組蛋白抑制劑

高水平的循環(huán)組蛋白與許多疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。組蛋白作為NETs前饋回路的組成部分,不僅能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫失衡,還對(duì)肺部組織細(xì)胞具有直接的細(xì)胞毒性。而非抗凝肝素已被證明在體外結(jié)合組蛋白并中和其細(xì)胞毒性,明顯降低相關(guān)炎癥性疾病模型死亡率[39]。此外,研究發(fā)現(xiàn),抗凝血肝素還可以從NETs的染色質(zhì)纖維中去除組蛋白,破壞NETs的完整性,以實(shí)現(xiàn)抗血栓的效果。可見組蛋白抑制劑在COPD中有潛在的治療作用,但需要進(jìn)一步研究。

越來越多的證據(jù)都表明,氣道及肺組織中過度累積的 NETs參與COPD的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。因此針對(duì)NETs的靶向治療,可能是未來COPD治療重要研究方向。雖然NETs 在COPD中的具體作用機(jī)制及相關(guān)信號(hào)通路的研究目前仍處于起步階段,但隨著 NETs相關(guān)分子機(jī)制的不斷深入研究,其有望成為COPD治療策略新靶點(diǎn)。