植物乳桿菌CCFM 8661調節腸道菌群及緩解便秘研究

張晨玥,馬微微,盧慧敏,王琳琳*,劉小鳴,王剛,趙建新,張灝

1(江南大學 食品學院,江蘇 無錫,214026)2(黑龍江中醫藥大學 藥學院,黑龍江 哈爾濱,150006)

便秘是一種發病率較高、覆蓋人群較廣的胃腸道功能紊亂性疾病[1-2]。中華醫學會消化病學分會胃腸動力學組在2019年發布文件《中國慢性便秘專家共識意見(2019)》,其中數據顯示在我國大約有5 000萬的成年人存在便秘的困擾,相當于患病率為4.0%～10.0%。并且便秘的患病率也隨著年齡的增長逐年呈現上升的趨勢,其中>70歲人群患病率達23.0%,>80歲可達38.0%,還有高達80%的患者需要接受長期照護[3]。便秘除具有排便困難,排便頻率低,糞便干硬等臨床癥狀外[4],還會導致腸道菌群失調[2, 5]。目前,藥物依舊是治療便秘的主要途徑,但這些藥物或多或少都具有一些毒副作用。近年來,腸道菌群已成為科研領域的研究熱點,膳食、腸道菌群與疾病之間的相關性研究則是重中之重,因此通過膳食補充益生菌緩解便秘也順理成章的成為可能。

益生菌作為一種活的微生物具有諸多益生特性,當攝入足夠數量的益生菌時,就能夠對宿主產生眾多正向的益處。乳桿菌屬中的大多數菌株都具有益生作用,其中的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)就是最有代表性的[6]。我們實驗室的明星菌株L.plantarumCCFM 8661在前期的動物實驗和臨床試驗中均展現出良好的益生作用。例如減除重金屬,緩解重金屬毒性,清除幽門螺旋桿菌,緩解過敏性皮炎等[7-9]。雖然有眾多研究表明植物乳桿菌能夠緩解便秘[10-11],但L.plantarumCCFM 8661這株菌是否具有緩解便秘的作用,目前尚未可知。基于此,本研究旨在通過動物實驗,研究L.plantarumCCFM 8661是否具有調節腸道菌群及緩解便秘的作用,并初步探討其機制,針對具有治療便秘功能的產品開發提供更多的思路,也為L.plantarumCCFM 8661新功能的開發和應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實驗菌株及材料

L.plantarumCCFM 8661凍干粉(3×1011CFU/g),格樂瑞(無錫)營養科技有限公司;疊氮鈉-結晶紫-七葉苷瓊脂、伊紅美藍瓊脂、BBL瓊脂、Lbs瓊脂、TSC瓊脂,青島海博生物技術有限公司;鹽酸洛哌丁胺(loperamide hydrochloride)膠囊,西安楊森制藥有限公司;阿拉伯樹膠粉、活性炭粉、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸,國藥集團化學試劑公司;小鼠乙酰膽堿(acetylcholine,ACH)、小鼠胃泌素(gastrin,GAS)、小鼠酪酪肽(peotide YY,PYY)、小鼠P物質(substance P,SP)、小鼠胃動素(mouse motilin,MTL)、小鼠5羥色胺(5-hydroxy tryptamine,5-HT)、小鼠血管活性腸肽(vasoactive intestinal peptide,VIP)、小鼠生長抑素(somatostatin,SS)、小鼠白細胞介素1(interleukin-1,IL-1)、小鼠白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、小鼠白細胞介素8(interleukin-8,IL-8)、小鼠白細胞介素10(interleukin-10,IL-10)、小鼠轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β) ELISA試劑盒,上海酶聯生物科技有限公司。

1.1.2 儀器與設備

真空冷凍干燥機,美國LABCONCO公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;1300-ISQ GC-MS,美國Thermo 公司;SCIENTZ-48高通量組織研磨器,寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 動物實驗設計

50只6周齡SPF級C57BL/6 J雄性小鼠經過1周的適應喂養后,隨機分為5小組:空白對照組、模型組、低劑量L.plantarumCCFM 8661組、中劑量L.plantarumCCFM 8661組、高劑量L.plantarumCCFM 8661組。第8～28天,空白對照組和模型組灌胃無菌生理鹽水,低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌胃無菌生理鹽水重懸的1.5×106、1.5×107、1.5×108CFU/mL的L.plantarumCCFM 8661菌液;灌胃劑量為0.2 mL。第29～35天,空白對照組灌胃無菌生理鹽水,其他組灌胃10 mg/kg·BW鹽酸洛哌丁胺,1 h后,模型組灌胃無菌生理鹽水,菌干預組灌胃相對應劑量(高、中、低劑量)的L.plantarumCCFM 8661菌液,灌胃劑量均為0.2 mL。試驗期間飼喂小鼠標準飼料,每周對小鼠糞便進行收集并盡快保存于-80 ℃冰箱備用。實驗結束后,給予小鼠腹腔注射100 mg/kg·BW的氯胺酮,麻醉完成之后采取摘眼球取血,然后脫頸椎處死小鼠。血液在4 ℃,3 000×g條件下離心10 min,分裝血清后-80 ℃凍存備用。具體實驗分組及動物實驗流程分別見表1和圖1。實驗所需動物全部購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司。實驗期間,所有小鼠自由進食進水并喂養于IVC籠盒中,飼養環境條件如下:溫度(25±2) ℃、濕度(50±5)%、12 h光照和12 h黑夜。本動物實驗中所用的方法均經過江南大學倫理委員會審閱并批準(JN.No20211215c1200515[531]),并符合歐盟實驗動物指南(Directive 2010/63/EU)。

圖1 動物實驗流程圖Fig.1 Animal experiment schedule

表1 動物實驗分組情況一覽表Table 1 List of animal testing groups

1.3 實驗方法

1.3.1 調節腸道菌群功能實驗

參考《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版)》中“有助于調節腸道菌群檢驗方法”進行實驗設計和相關指標測定。此處調節腸道菌群,我們選擇了兩種不同狀態下,L.plantarumCCFM 8661對小鼠菌群的影響。(1)在正常菌群狀態下(7～28 d):分別無菌采取第7天和第28天小鼠肛門內糞便2～3粒,放置于無菌離心管中備用;(2)在菌群紊亂狀態下(29～35 d):同樣在無菌的條件下采集第35天的糞便備用。按照如下的檢測方法檢測腸道菌群:首先稱量兩種不同狀態下的糞便濕重后進行10倍系列稀釋,選擇菌落數在30～300的稀釋度,接種在對應的培養基上進行培養,根據菌落形態、革蘭氏染色鏡檢、生化反應等鑒定計數菌落[12],計算每克濕便中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌的菌數,結果取對數(lg CFU/g)后進行統計。

1.3.2 便秘相關指標測定

1.3.2.1 糞便含水量

每周收集小鼠糞便用于糞便含水量的檢測。方法如下:將灌胃結束后的小鼠單獨放入墊有濾紙的潔凈籠盒中,收集新鮮糞便,稱重后冷凍干燥,根據公式(1)計算糞便含水量:

(1)

1.3.2.2 排首粒黑便時間

實驗第35天,灌胃0.2 mL鹽酸洛哌丁胺和活性炭的混合溶液,將每只小鼠灌胃墨汁時間到其排出第一粒黑便時的時長記錄為排首粒黑便時間。超出模型組最后一只小鼠排首粒黑便時間的處理組則說明無效,將各個處理組與模型組進行比較,用于說明各組在緩解便秘方面的差異。

1.3.2.3 小腸推進率

解剖前12 h對小鼠禁食不禁水處理,第36天除正常組外的所有組小鼠灌胃0.2 mL鹽酸洛哌丁胺和活性炭的混合液,正常組灌胃無菌生理鹽水和活性炭混合溶液,30 min后處死小鼠,打開小鼠腹腔后剪取幽門至盲腸的腸管,并將此腸管拉成直線,測量腸管長度為“小腸總長度”,從幽門到墨汁前沿的長度為“活性炭溶液前端推進長度”[13],根據公式(2)計算小腸推進率:

(2)

1.3.3 小鼠血清中神經遞質、炎癥因子的測定

用ELISA試劑盒測定小鼠血清中便秘相關胃腸調節遞質含量:MTL、GAS、SP、VIP、SS、PYY、ACH、5-HT、IL-1, IL-6, IL-8, IL-10、TGF-β的水平,上述操作方法按照說明書要求進行操作。

1.3.4 小鼠糞便中短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的測定

稱取30 mg左右凍干小鼠糞便,小鼠糞便中SCFAs的抽提及檢測方法參照毛丙永[14]的方法,GC-MS檢測選取全波長掃描。采用外標法繪制不同SCFA的標準曲線,根據得到的標準曲線計算樣品中SCFAs濃度(μmol/g)。

1.3.5 數據統計與分析

實驗數據均以“平均值±標準差”表示,用SPSS軟件進行方差分析,P<0.05即判定為差異顯著。實驗結果參考《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版)》中“有助于調節腸道菌群檢驗方法”進行陽性結果判定。利用GrapaPad Prism 8.0作圖、數據比較。

2 結果與分析

2.1 L.plantarum CCFM 8661有助于調節小鼠腸道菌群

2.1.1L.plantarumCCFM 8661對小鼠體重的影響

經L.plantarumCCFM 8661干預后,小鼠體重在正常和菌群紊亂兩種狀態下的情況如表2和表3所示。

表2 在正常菌群狀態下L.plantarum CCFM 8661對小鼠體重的影響(±SD) 單位:gTable 2 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on the body weight of mice under normal microbiota condition(±SD)

表3 在菌群紊亂狀態下L.plantarum CCFM 8661對小鼠體重的影響(±SD) 單位:gTable 3 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on the body weight of mice under disorder microbiota condition(±SD)

由表2可知,在正常菌群狀態下,與空白對照組相比,小鼠體重隨灌胃L.plantarumCCFM 8661劑量的提升而呈現顯著增加的趨勢(P<0.05)。而在菌群紊亂狀態下,小鼠體重在低、中、高劑量組與對照組間均無顯著性差異,以上結果表明,在健康狀態下,隨著時間的推移及一段時間益生菌的攝入,宿主的脾胃功能得到改善,進食量提高而出現體重提高的情況[15];菌群紊亂狀態下由于造模藥物的影響和腸道菌群的改變,小鼠體重雖有不同程度增加,但并沒有顯著性差異[16]。

2.1.2L.plantarumCCFM 8661對小鼠腸道菌群的影響

2.1.2.1 正常菌群狀態下L.plantarumCCFM 8661對小鼠腸道菌群的影響

在正常菌群狀態下,通過為期3周的L.plantarumCCFM 8661干預,小鼠腸道中雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌的變化情況如圖2所示,糞便中雙歧桿菌和乳桿菌的數量在3種不同劑量的L.plantarumCCFM 8661干預后均顯著增加(P<0.05),而腸桿菌、腸球菌和產氣莢膜梭菌的數量在干預前后無顯著性變化。結合《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版)》中“有助于調節腸道菌群檢驗方法”中陽性結果判定標準,說明L.plantarumCCFM 8661具有調節小鼠腸道菌群的作用。劉偉賢等[17]的研究結果顯示,干酪乳桿菌K56具有調節腸道菌群的功能,能夠顯著提高小鼠腸道內益生菌含量,并且使條件致病菌含量降低,本研究結果與其相一致,當補充足夠益生菌會改變機體的腸道菌群[18]。

a-雙歧桿菌;b-乳桿菌;c-腸球菌;d-腸桿菌;e-產氣莢膜梭菌圖2 正常菌群狀態下L.plantarum CCFM 8661對小鼠腸道菌群的影響Fig.2 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on intestinal microflora of mice under normal microbiota condition注:*表示干預前后對比差異有顯著性,其中*代表P<0.05,**代表P<0.01,***代表P<0.001,****代表P<0.000 1;#表示與陰性對照組比較差異有顯著性,P<0.05(圖3、圖7同)。

2.1.2.2 菌群紊亂狀態下L.plantarumCCFM 8661對小鼠腸道菌群的影響

在菌群紊亂狀態下,L.plantarumCCFM 8661干預后,小鼠腸道菌群內雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌、產氣莢膜梭菌的變化情況如圖3所示,不論是實驗組實驗前后自身比較,還是實驗后實驗組與對照組組間比較,糞便中雙歧桿菌在3種不同劑量的L.plantarumCCFM 8661干預后均顯著增加(P<0.05),而腸桿菌、腸球菌和產氣莢膜梭菌的數量在干預前后無顯著性變化。結合《保健食品功能檢驗與評價方法(2022年版)》中“有助于調節腸道菌群檢驗方法”中陽性結果判定標準,說明L.plantarumCCFM 8661具有調節小鼠腸道菌群的作用。早前就有研究提到乳桿菌能夠有效調節腸道菌群失衡,恢復菌群數量[19-20]。

a-雙歧桿菌;b-乳桿菌;c-腸球菌;d-腸桿菌;e-產氣莢膜梭菌圖3 菌群紊亂狀態下L.plantarum CCFM 8661對小鼠腸道菌群的影響Fig.3 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on intestinal microflora in mice under the condition of microbiota disorder注:##表示與陰性對照組比較差異有顯著性(P<0.01)。

綜上所述,不論是在正常菌群狀態下,還是在菌群紊亂狀態下,L.plantarumCCFM 8661均具有調節宿主腸道菌群的作用。

2.2 L.plantarum CCFM 8661具有緩解小鼠便秘的趨勢

導致便秘的原因比較復雜,在臨床上便秘多表現為自發性排便頻率低、排便費力且費時、糞便干硬等[4]。本文應用洛哌丁胺構建便秘模型,通過檢測便秘相關指標(糞便含水量、小腸推進率、排首粒黑便時間)發現,與空白組相比,洛哌丁胺顯著降低了小鼠的糞便含水量(圖4-a),延長了小鼠整個腸道的傳輸時間(排首粒黑便時間)(圖4-b)以及小腸推進率(圖4-c)。這些結果表明應用洛哌丁胺可成功構建小鼠便秘模型。

a-糞便含水量;b-排首粒黑便時間;c-小腸推進率圖4 L.plantarum CCFM 8661對小鼠便秘相關指標的影響Fig.4 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on constipation-related indexes in mice注:*表示與模型對照組比較差異顯著,其中*代表P<0.05,****代表P<0.000 1(圖5、圖6同)。

應用不同劑量的L.plantarumCCFM 8661處理便秘小鼠后,其對便秘相關指標的影響不同。對于糞便含水量,結果如圖4-a所示,不同劑量菌處理組與模型組相比雖無顯著性差異,但具有提高糞便含水量的趨勢。對于排首粒黑便時間,結果如圖4-b所示,經不同劑量的L.plantarumCCFM 8661處理后,小鼠的排首粒黑便時間顯著降低,且其降低整個腸道通過時間的效果與其濃度無關(P<0.05)。對于小腸推進率,結果如圖4-c所示。經不同劑量L.plantarumCCFM 8661處理后,小鼠小腸推進率較模型組有提高,但并無顯著性,其中低劑量組小鼠小腸推進率效果最好。

綜合3種不同劑量L.plantarumCCFM 8661干預后對小鼠便秘3個表觀指標的影響情況可知,低劑量L.plantarumCCFM 8661具有緩解便秘的潛力。這與我們前期臨床試驗的結果相一致。前期的臨床結果發現,低劑量植物乳桿菌具有緩解便秘的效果,而高劑量的植物乳桿菌則會加重便秘癥狀。同時,唐田等[11]關于植物乳桿菌P9對小鼠功能性便秘作用研究中也表現出了中劑量組緩解效果優于高劑量組的相同結果,這就說明植物乳桿菌在緩解便秘時,其添加量并不是越多越好,需要在一定的范圍內才能起到緩解疾病的目的,這可能與雙歧桿菌與其競爭消化道定植位點,改變腸道pH、氧氣含量等腸道內環境和腸道微生物組成有關[21]。

2.3 低劑量L.plantarum CCFM 8661能夠調控小鼠血清中神經遞質和炎癥因子水平

2.3.1L.plantarumCCFM 8661對小鼠血清中神經遞質的影響

便秘會通過對胃腸調節遞質和神經營養因子的影響,進而改變腸道的轉運能力。胃腸調節遞質可以分為興奮型胃腸調節遞質和抑制型胃腸調節遞質,其含量的改變會使宿主腸道功能發生變化[22]。通過與模型組的比較探究L.plantarumCCFM 8661對小鼠體內便秘相關胃腸調節遞質的影響,結果如圖5所示。與模型對照組比較,低劑量組能夠顯著提高小鼠血清中4種興奮型胃腸調節遞質(MTL、GAS、SP、ACH)的含量,并且使4種抑制型胃腸調節遞質(VIP、SS、PYY、5-HT)的含量顯著降低(P<0.05);高劑量組的MTL含量較模型組有顯著的升高(P<0.01),VIP、PYY、5-HT含量較模型組有顯著的降低(P<0.05)。綜合上述結果表明低劑量的L.plantarumCCFM 8661可改變由便秘所引起的胃腸調節遞質的變化。這也與低劑量L.plantarumCCFM 8661可緩解便秘結果相一致,說明L.plantarumCCFM 8661可能是通過改變腸道內神經遞質的含量進而發揮緩解便秘的效果。而L.plantarumCCFM 8661如何影響腸道內便秘相關胃腸調節遞質的變化情況則是我們下一步的研究重點。

a-MTL;b-GAS;c- SP;d-乙ACH;e-VIP;f-SS;g-PYY;h-5-HT圖5 L.plantarum CCFM 8661對小鼠血清中神經遞質的影響Fig.5 Effects of L.plantarum CCFM 8661 on serum neurotransmitters in mice注:*表示與模型對照組比較差異顯著,其中**代表P<0.01,***代表P<0.001(圖6同)。

2.3.2L.plantarumCCFM 8661對小鼠血清中炎癥因子的影響

促炎細胞因子由Th1細胞、CD4+細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞分泌。其特征在于生成多種白細胞介素。例如IL-1、IL-2、IL-8、IL-12、IL-17, IL-18、IFN-γ和TNF-α等。本文主要針對幾個關鍵的促炎細胞因子IL-1、IL-6、IL-8和抑炎細胞因子IL-10等展開研究。結果如圖6所示。低劑量L.plantarumCCFM 8661處理組能顯著下調小鼠血清中促炎細胞因子IL-1、IL-6、IL-8的含量,上調抑炎細胞因子IL-10的含量,而其他2個劑量處理組則對部分細胞因子有影響。此結果與低劑量L.plantarumCCFM 8661緩解便秘的結果相一致,說明L.plantarumCCFM 8661緩解便秘可能是通過改變小鼠體內炎癥因子的水平實現的。這也與我們前期的研究結果,便秘同時伴有低水平的炎癥,雙歧桿菌在緩解便秘的同時,降低了由于便秘所引起的炎癥因子的水平[23]。

a-IL-1;b-IL-6;c-IL-8;d-IL-10;e-TGF-β圖6 L.plantarum CCFM 8661對小鼠血清中炎癥因子的影響Fig.6 Effects of L.plantarum CCFM 8661 on serum inflammatory factors in mice

2.4 L.plantarum CCFM 8661上調便秘小鼠糞便中乙酸含量

SCFAs主要包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸等,其產生主要是由于微生物發酵未被消化的碳水化合物或蛋白質。本文主要針對腸道內最主要的3種SCFAs(乙酸、丙酸、丁酸)進行檢測。結果如圖7所示,洛哌丁胺造模后便秘小鼠的乙酸、丙酸、丁酸的含量都有下降的趨勢,不同劑量的L.plantarumCCFM 8661干預后,與模型組相比,低劑量組和高劑量組便秘小鼠糞便中乙酸的含量顯著升高(P<0.05),而丙酸和丁酸含量并無統計學差異。眾多研究顯示便秘患者糞便中乙酸含量會出現下調的情況[24],我們的結果也提示L.plantarumCCFM 8661緩解便秘可能與糞便中乙酸含量上調有關,下一步擬定通過直接給予不同的SCFAs驗證其對便秘的緩解作用。

a-乙酸;b-丙酸;c-丁酸圖7 L.plantarum CCFM 8661對便秘小鼠糞便中SCFAs含量的影響Fig.7 Effect of L.plantarum CCFM 8661 on the content of SCFAs in the feces of constipated mice

3 結論

本研究針對L.plantarumCCFM 8661調節腸道菌群及緩解便秘效果展開研究。研究發現,宿主無論處于正常菌群狀態下或處于菌群紊亂狀態下,L.plantarumCCFM 8661的攝入都能顯著改變宿主的腸道菌群,主要是提高宿主腸道內雙歧桿菌和乳桿菌的含量,而對于腸桿菌、腸球菌和產氣莢膜梭菌的數量無影響。同時低劑量的L.plantarumCCFM 8661的攝入具有緩解便秘的潛力,主要表現在提高了宿主整個腸道的蠕動時間,且其緩解便秘可能是通過調節宿主腸道內與便秘相關的胃腸調節遞質的含量,上調SCFAs中乙酸水平,降低便秘所引起的宿主炎癥因子的水平實現的。