典型加強型葡萄酒香氣特征及主要揮發性成分分析

何曦,陳方圓,孫文靜,鄭明鵬,宋琳娜,朱袁正鴻,樊西曼,張軍翔,3*

1(寧夏大學 農學院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學 食品與葡萄酒學院,寧夏 銀川,750021)3(葡萄與葡萄酒教育部工程研究中心,寧夏 銀川,750021)

加強型葡萄酒(fortified wines)又稱利口葡萄酒,指加入葡萄酒精或白蘭地終止部分發酵或未發酵的葡萄酒,使部分葡萄糖和果糖保留在酒中,經過陳化最終得到自然甜型的加強型葡萄酒[1]。在一些歐洲國家中,利用這種獨特工藝生產的加強型葡萄酒已至少有300年的歷史[2]。雪莉、波特和馬德拉酒是3種典型的加強型葡萄酒,這類酒的特點是酒精和總糖含量較高,酒精含量通常在15%～22%(體積分數),含糖量通常在60 g/L以上[3]。高酒精度抑制微生物生長,提高了酒的穩定性;高糖分會引起美拉德反應并產生大量的揮發性成分,其中葫蘆巴內酯、糖醛和5-甲基糠醛等是高糖高酒精作用下典型的香氣物質[4-6]。不同加強型葡萄酒因不同的工藝特別是陳化過程不同,會存在香氣感官特性的差異。

雪莉酒(Sherry)是產自西班牙南部的赫雷斯(Jerez)地區,由當地白葡萄品種“帕羅米諾(Palomino)”釀造而成。通常雪莉酒在橡木桶的陳釀中,表面會形成一層叫做“酒花”的酵母膜,這種生物膜是由一種弗洛爾酵母菌(Flor yeasts)生成[7],這種酵母在生物老化過程中發生自溶現象,自溶過程會溶解出許多化合物,如氨基酸、肽、核苷酸、酯、醇、醛、酸和內酯等化合物,其中葫蘆巴內酯、異丁醇、2-苯基乙醇和異戊醇等揮發物都會對雪莉酒獨特風味的形成產生影響[8-11]。波特酒(Port)產于葡萄牙波爾圖市的杜羅地區,通常波特酒的典型風味是來自橡木桶中長時間的陳釀,口感呈現堅果、辛辣和橡木的味道[12]。ROGERSON等[13]的研究發現波特酒在陳化過程中己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯等揮發性成分在酒中大幅增加,提高了酒中的果味和辛辣等復雜的香氣。馬德拉酒(Madeira wine)產于葡萄牙的馬德拉群島,通常要將酒加熱至50 ℃陳化3個月[14],在此過程中馬德拉酒產生葫蘆巴內酯、5-甲基糠醛和糠醛等典型風味物質,賦予馬德拉酒烘烤、焦糖和堅果味[15]。而非加強型葡萄酒的釀造工藝通常需要將糖發酵至4 g/L以下,酒精度為12%～15%(體積分數),由于含糖低和酒精度低,葡萄酒呈現出果香、花香和青椒味[16]。不同類型的加強型葡萄酒都具有獨特的香氣特征,但高酒精度和高糖的條件下陳釀必然會有共有的香氣特征和揮發性成分,目前此方面的研究鮮有報道。

本研究選取典型加強型葡萄酒作為研究對象,以賀蘭山東麓產區的紅、白葡萄酒為對照,探究典型加強型葡萄酒的香氣感官特征及揮發性成分的差異,為后續加強型葡萄酒的生產和質量評價提供基礎數據支撐和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒樣:收集相似年份的西班牙雪莉酒、葡萄牙波特酒和馬德拉酒各3款,賀蘭山東麓產區干紅葡萄酒和白葡萄酒各3款,其中雪莉酒和白葡萄酒由白色葡萄品種釀造,馬德拉酒、波特酒和干紅葡萄酒由紅色葡萄品種釀造,具體信息見表1。

表1 酒樣信息Table 1 Information on wine samples

試劑:沒食子酸(分析純),煙臺市雙雙化工有限公司;NaOH、NaCl、酚酞、無水葡萄糖、次甲基藍(均為分析純),天津市科密歐化學試劑有限公司;福林酚,上海瑞永生物科技有限公司;HCl,國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、酒石酸鉀鈉(均為分析純),天津市永大化學試劑有限公司;Na2CO3、CuSO4、鄰苯二甲酸(均為分析純),天津市大茂化學試劑有限公司;4-甲基-2-戊醇(≥98.0%, GC),日本TCI公司;C8～C20正構烷烴(≥99.7%, GC),美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

7890B-7000D型氣相色譜-質譜聯用儀、DB-WAX色譜柱(60 m×250 μm, 0.25 μm),美國Agilent公司;PAL3自動進樣器,瑞士CTC公司;TU-1901型分光光度計,北京普析通用儀器有限公司;雷磁PHS-3C pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;ME104E電子天平,瑞士METTLE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 理化指標測定

可滴定酸、總糖、二氧化硫的測定方法參照 GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》;酒精度的測定方法參數GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測度》;pH值使用pH計測定;總酚的測定參照福林-肖卡法[17]的方法測定;單寧的測定參照李蕊蕊[18]的方法測定;色度、色調的測定參照鄭秋玲等[19]的方法。

1.3.2 揮發性成分測定

參考張眾等[20]的方法利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術對典型加強型葡萄酒(雪莉酒、波特酒和馬德拉酒各3款)和非加強型葡萄酒(干紅葡萄酒和白葡萄酒各3款)進行揮發性成分檢測。

樣品前處理:在20 mL的頂空瓶中依次放入1.5 g NaCl、 5 mL酒樣、10 μg/L的4-甲基-2-戊醇(內標,1.008 3 g/L)和磁力轉子,再將頂空瓶置于磁力攪拌機中,并放入纖維萃取頭,在50 ℃水溫和轉速250 r/min下萃取30 min。

質譜條件:離子源溫度230 ℃;傳輸線溫度230 ℃;電子能量70 eV;質量掃描范圍m/z29～300。

色譜條件:載氣高純氦氣(純度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流進樣;DB-WAX色譜柱(60 m×250 μm, 0.25 μm);進樣口溫度230 ℃;升溫程序:起始柱溫度50 ℃,恒溫1 min,以3 ℃/min升至220 ℃。

1.3.3 定性與定量分析

將揮發性成分的香氣質譜圖,通過NIST 17譜庫進行檢索,確定揮發性成分,并使用保留指數法(retention index,RI)計算各揮發性成分的保留指數從而進行定性分析。采用外標法進行定量,定量分析使用62種不同揮發性成分制成的混合物,進行校準曲線定量,所有的標準分析各做2次;對于典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒中沒有參考的揮發性成分根據相近結構的化合物標準進行定量[21];共有12種揮發性成分(2-糠酸乙酯、戊二酸二乙酯、葫蘆巴內酯、肉豆蔻酸乙酯、肉桂酸乙酯、正癸醇、苯甲醇、葉醇、橙花叔醇、2-羥基-3-甲基丁酸、5-甲基糠醛和2,4-二叔丁基苯酚)使用相近標準濃度進行定量,并用于數據分析。

1.3.4 香氣特征感官分析

由20名具有2年以上品酒經驗的專業人員(年齡20～45歲、男女比例11：9)組成感官品鑒小組。參考楊洋等[22]的定量描述法,每位感官品鑒員盡可能多地描述外觀、香氣、口感等感官描述詞,最終通過感官品鑒小組共同討論形成典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒的感官描述詞及定義。按照GB/T 29604—2013的方法確定合適的感官描述詞。

將選出的酒樣感官描述詞呈給感官品鑒員,典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒以盲品的方式進行,在標準品酒室(ISO 8589—1998)使用標準品酒杯(ISO 3591—1997)進行評鑒。品鑒表制定參照葡萄酒風味化學中的評分規則對典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒的香氣特征進行打分[23],香氣特征及評分依據見表2。

表2 香氣特征及評分依據Table 2 Rules for aroma characteristic scoring

1.3.5 氣味活度值的計算

采用氣味活度值(odour activity value,OAV)法,參考文獻[24]的算法,OAV按照公式(1)進行計算:

(1)

式中:濃度為定量后的揮發性成分濃度。

1.3.6 數據統計分析

采用Microsoft Office 2021軟件進行數據統計;OAV>1的揮發性成分進行主成分分析(principal component analysis,PCA),感官輪廓圖以及揮發性成分的聚類熱圖,用Origin 2021軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 基本理化指標分析

典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒的理化指標如表3所示,典型加強型葡萄酒的酒精度和總糖都高于非加強型葡萄酒;典型加強型葡萄酒總酸的范圍為2.97～4.89 g/L普遍低于葡萄酒,這與其他甜型葡萄酒高酸平衡高糖的情況不同[25];SW色度的范圍為1.41～2.78,色調的范圍為2.93～3.90,而WW色度和色調的范圍為0.24～0.35和0.85～0.92,說明SW的顏色較深,黃色色調較深;RW、PW和MW的色度范圍依次為10.81～12.64、9.23～11.23和1.11～5.90,色調依次為0.91～0.97、0.93～1.00和2.67～3.91,表明RW的顏色較深,紅色色調較重;典型加強型葡萄酒色度大小不一,但色調偏高,也說明加強型葡萄酒的顏色主要和褐變反應有關[26]。加強型葡萄酒中,酚類物質的氧化會導致酒體抗氧化能力的降低,但會產生新的多酚類化合物,對加強型葡萄酒的顏色和味道產生影響[27-28]。典型加強型葡萄酒總酚的范圍為209.57～1 794.80 mg/L,均低于RW,其中MW的總酚含量在典型加強型葡萄酒中含量較高;典型加強型葡萄酒的單寧范圍為193.80～429.67 mg/L,其中RW的單寧含量高于MW和PW;SW的單寧含量遠高于WW。如表3所示,非加強型葡萄酒總硫、游硫、總糖等基本理化指標,均在規定范圍之內;典型加強型葡萄酒的總硫都遠低于非加強型葡萄酒,游硫為0,也說明酒精對加強型葡萄酒起到主要保護作用。

表3 典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒的基本理化指標Table 3 Basic physiochemical indices of typical fortified and non-fortified wines

2.2 典型加強型葡萄酒的香氣特征感官分析

高糖和高酒精的環境使加強型葡萄酒具有獨特的風味和揮發性成分[29]。由圖1可知,3種典型加強型葡萄酒(圖1-A～圖1-C)的整體香氣輪廓面積都大于非加強型葡萄酒(圖1-D、圖1-E),說明具有更加濃郁的香氣;典型加強型葡萄酒共同的香氣特征以堅果、焦糖、甜香和奶油味為主,均明顯高于非加強型葡萄酒,可作為加強型葡萄酒的典型香氣特征;SW(圖1-A)在典型加強型葡萄酒中的奶油味分值評分較高(6.24分),可作為SW的獨特香氣特征;PW(圖1-C)在典型加強型葡萄酒中的紅色水果、青草和薄荷味評分較高,依次為4.11、2.84、2.98分,感官特征與文獻的結果一致[6,30];MW(圖1-B)的烘烤(7.73分)、堅果(7.42分)、橡木(3.60分)、巧克力(3.49分)、甜香(7.09分)和焦糖味(7.33分)的感官評分較高。3款典型的加強型葡萄酒具有不同的香氣特征與不同的原料組成、發酵工藝和陳化過程有關[23];雪梨酒的獨特香氣特征與發酵過程中酒花的形成有關;波特酒獨特的香氣特征與發酵工藝及葡萄原料有關;馬德拉酒獨特的香氣特征與加熱陳化和橡木桶陳釀有關。非加強型葡萄酒的感官特征與典型加強型葡萄酒明顯不同,RW(圖1-D)突出的感官特征為紅色水果(6.40分)和青草味(2.80分),WW(圖1-E)為香蕉(4.00分)、花香(6.52分)和蜂蜜味(5.34分)。加強型葡萄酒獨特的感官特征與高酒精和高糖有密切關系,陳化過程中發生的氧化反應、美拉德反應、褐變現象和焦糖化反應等,賦予加強型葡萄酒獨特的感官特征[5,28]。

A-雪莉酒感官輪廓圖;B-馬德拉酒感官輪廓圖;C-波特酒感官輪廓圖;D-干紅葡萄酒感官輪廓圖;E-白葡萄酒感官輪廓圖圖1 典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒感官輪廓圖Fig.1 Sensory profiles of typical fortified and non-fortified wines

2.3 典型加強型葡萄酒的揮發性成分分析

利用Origin 2021軟件對15款酒樣進行熱圖分析,探究典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒的揮發性成分差異。揮發性成分的含量由藍色到紅色依次增加,由圖2可以看出不同酒類的揮發性成分存在明顯差異。聚類熱圖將57種揮發性成分聚為4類:第1類揮發性成分在SW和MW中含量較高,包括丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、葉醇等22種物質;第2類揮發性成分在PW中含量較高,包括異丁醇、異戊醇、正己醇等6種物質;第3類和第4類揮發性成分在WW和RW中含量較高,包括乙酸異戊酯、丙醇、乙酸己酯等29種物質。在第1類和第2類揮發性成分中,SW揮發性成分的豐富度明顯高于MW和PW,而MW和PW的豐富度基本相同;第3類和第4類揮發性成分在非加強型葡萄酒中含量較高,且WW的揮發性成分豐富度明顯高于RW。

圖2 典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒揮發性成分的聚類熱圖Fig.2 Clustering heatmap of volatile components in typical fortified and non-fortified wines

為了進一步探究典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒中起主要作用的揮發性成分,故將SW、MW和PW的揮發性成分歸為典型加強型葡萄酒,將RW和WW的揮發性成分歸為非加強型葡萄酒。采用OAV[31]分析酒樣中揮發性成分對主體揮發性成分的貢獻,當OAV>1時,說明該揮發性成分對酒的主體揮發性成分有貢獻[32]。典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒中OAV>1的揮發性成分如表4所示,共有27種揮發性成分可作為具有貢獻的揮發性成分。典型加強型葡萄酒中OAV>1的有丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯等18種揮發性成分,其中2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、苯乙酸乙酯等9種揮發性成分是典型加強型葡萄酒特有的;非加強型葡萄酒中OAV>1的有丁酸乙酯、正己酸乙酯、月桂酸乙酯等18種揮發性成分,其中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯等9種揮發性成分是非加強型葡萄酒中特有的。典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒之間的感官差異可能和特有的揮發性成分有關。

表4 典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒部分揮發性成分香氣活度值Table 4 OAVs of several volatile components in typical fortified and non-fortified wines

根據香氣值理論,葡萄酒中揮發性成分含量高閾值低的成分很可能是主要的揮發性成分[36]。結合圖2和表4可以看出,在典型加強型葡萄酒中OAV>1且特有的揮發性成分有9種(2-甲基丁酸乙酯、異戊酸乙酯、苯乙酸乙酯、葫蘆巴內酯、糖醛、苯甲醛、4-乙基-2-甲氧基苯酚和4-乙基苯酚);除此之外還有9種揮發性成分在典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒中共有,但含量較高和OAV>1的揮發性成分有3種(丁酸乙酯、苯乙醇和異戊醇)。其中能給典型加強型葡萄酒帶來堅果味[7,33-34]的是葫蘆巴內酯、異戊醇、糖醛和苯甲醛,帶來甜香[7,34-35]的是2-甲基丁酸乙酯、4-乙基苯酚、異戊酸乙酯、苯乙醇和2,4-二叔丁基苯酚,這9種揮發性成分的OAV>1,且含量都高于非加強型葡萄酒,故可視為典型加強型葡萄酒的主要揮發性成分,與之前報道部分一致[37]。因此典型加強型葡萄酒中獨特的香氣和風味物質與這些主要揮發性成分有關,且都與感官特征具有很高的吻合性。

在非加強型葡萄酒中OAV>1且特有的揮發性成分有9種(月癸酸乙酯、乙酸苯乙酯、3-苯丙酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸己酯、芳樟醇、庚醇、癸酸和癸醛);除此之外還有9種揮發性成分在典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒中共有,但含量較高和OAV>1的揮發性成分有6種(正己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸異戊酯、辛酸和大馬士酮)。其中能給非加強型葡萄酒帶來果香[34]的有正己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、肉桂酸乙酯、乙酸己酯和大馬士酮,花香[35]的有乙酸苯乙酯、芳樟醇和癸醛,蜂蜜味[7]的有3-苯丙酸乙酯,香蕉味[35]的有乙酸異戊酯,這12種成分的OAV>1,且含量都高于典型加強型葡萄酒,可視為非加強型葡萄酒的主要揮發性成分,與之前的報道具有一致性[30, 32, 38]。

揮發性成分含量和OAV的分析結果確定了典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒的主要揮發性成分。為了進一步驗證這些主要揮發性成分對典型加強型葡萄酒和非加強型葡萄酒的貢獻程度,對15款酒樣中具有貢獻的揮發性成分進行PCA(圖3)。

圖3 典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒OAV>1的揮發性成分主成分分析Fig.3 Principal component analysis of volatile components with OAV>1 in typical fortified and non-fortified wines

由圖3可知,PC1和PC2的貢獻率分別為49.8%和19.2%,累計貢獻率為69.0%;同一款酒樣的數據點聚集程度相對較好,表明同款酒樣的主要揮發性成分存在共性且差異性較小。PW和MW的數據點集中在PC1負向端,RW的數據點集中在PC1的正向端,表明MW和PW與干紅葡萄酒中具有貢獻的揮發性成分存在差異;SW和WW均位于PC2的正向端,SW主要分布在PC1的負向端,WW主要分布在PC1的正向端,表明2款酒樣的揮發性成分存在明顯差異;典型加強型葡萄酒整體分布在PC1的負向端,非加強型葡萄酒分布在PC1的正向端。由此說明典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒的主要揮發性成分的含量和差異較大,同款酒樣的差異較小。而這些揮發性成分的差異主要與加強型葡萄酒終止發酵的工藝及不同的葡萄原料有關,使加強型葡萄酒具有獨特的揮發性成分。

綜合典型加強型葡萄酒與非加強型葡萄酒揮發性成分OAV分析結果和PCA結果,兩者揮發性成分的貢獻程度存在較大差異,同種酒樣的主要揮發性成分的貢獻程度差異較小。由此可以確定篩選出的9種揮發性成分是典型加強型葡萄酒的主要揮發性成分,12種成分是非加強型葡萄酒中的主要揮發性成分。

3 結論

雪莉、波特和馬德拉酒作為典型的加強型葡萄酒,波特酒具有較深的紅色色調,雪莉酒和馬德拉酒具有較深的黃色色調;典型加強型葡萄酒具有堅果、焦糖、甜香和奶油等香氣特征,其中葫蘆巴內酯、異戊醇、糖醛、苯甲醛、2-甲基丁酸乙酯、4-乙基苯酚、異戊酸乙酯、苯乙醇和2,4-二叔丁基苯酚為典型加強型葡萄酒的主要揮發性成分。后續研究還需要進一步在原料保持一致的情況下,通過模擬不同加強型葡萄酒的釀造工藝開發相應產品并驗證結果。