副干酪乳酪桿菌PC-01復配劑量對發酵乳產品特性的影響

張哲,于學健,李宏,姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司,中國工業微生物菌種保藏管理中心,北京,100015)2(中國合格評定國家認可中心,北京,100062)

根據國際乳品聯合會[1](International Dairy Federation,IDF)和GB 19302—2010《食品安全國家標準 發酵乳》定義,發酵乳是指以乳或乳粉為原料,通過微生物作用后制成的pH值降低的產品。常用的發酵劑菌株有德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp.bulgaricus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus),同時可以使用其他我國衛生與健康委員會批準使用的菌株。

發酵乳作為一種傳統乳制品,在世界各地有著悠久的食用歷史。21世紀以來,隨著人們生活水平的不斷提高以及對健康的重視,對食品的訴求也在不斷提升,發酵乳取得快速的發展和廣泛的普及。此外,隨著素食人群的不斷增長和高蛋白飲食的普及,市場上發酵乳的需求也在不斷擴大。同時,乳糖不耐癥發病率的增加也是推動發酵乳消費的另一原因。發酵乳作為益生菌良好的載體,近些年來的研究和發展都非常迅速[2-4]。

酸奶是由德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌發酵產生,二者的相互作用構成了酸奶的基本理化特性、質構特征及代謝產物的組成。益生菌的加入除了帶來其本身的功能特點外,還會與發酵劑共同發酵,改變產品特征。在以往的研究中發現,瑞士乳桿菌(LactobacillushelveticusH9)對發酵乳質構的影響與其添加量有關,在低添加量(5×106CFU/g)時,發酵乳特征與僅添加商業發酵劑對照組最為相近。此外,L.helveticusH9的添加增加了發酵乳黏度,這可能是該菌株產胞外多糖所導致的[5]。LI等[6]的研究表明,植物乳桿菌對發酵乳理化及質構的影響與所添加的菌株相關,添加植物乳桿菌的發酵乳相較于對照組可以在貯藏期間保持產品的硬度,增加產品的穩定性。根據藥璐[7]的研究發現,添加植物乳桿菌LP 23508可以顯著提高發酵乳在貯藏第21天時的硬度與稠度。

相較于發酵乳產品的健康功效,質地和口感是決定消費者喜愛程度的首要因素。一株益生菌是否適合復配于發酵乳中,需通過產品的多種特征進行綜合判斷。副干酪乳酪桿菌PC-01分離自西藏拉薩地區自然發酵的酸牦牛乳中,此前的研究表明,該菌株消化液耐受性良好,同時可以促進葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導小鼠結腸炎的恢復[8]。此外,副干酪乳酪桿菌PC-01復配于發酵乳中可以提高產品的感官評分,特別是起始添加量為5×106CFU/g時,發酵乳在貯藏期間滋味評分上始終顯著高于商業化菌劑對照組,并且顯著增加產品中特征風味物質,如2,3-丁二酮和乙偶姻的含量[9]。本研究以不同劑量的副干酪乳酪桿菌PC-01與商業化發酵劑復配,探究不同添加量的菌株PC-01對發酵乳產品理化及質構特性帶來的影響,旨在確定該菌株在發酵乳中的最適添加劑量,為產品開發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

副干酪乳酪桿菌PC-01直投式菌粉,內蒙古農業大學。商業發酵劑YF-L904包含德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌,科漢森(中國)。

1.1.2 試驗試劑

純牛奶,內蒙古蒙牛乳業(集團)股份有限公司;白砂糖,廣西鳳糖生化股份有限公司;氯化鈉,廣東西隴化工廠;MRS肉湯培養基、萬古霉素,北京陸橋技術股份有限公司;瓊脂,青島海博生物技術有限公司;氫氧化鈉(分析純),天津科茂化學試劑有限公司;酚酞,天津市化學試劑三廠。

1.1.3 儀器與設備

FE28型pH計,梅特勒(上海)有限公司;恒溫水浴鍋、BHG-8082型恒溫培養箱,上海一恒科技有限公司;Brookfield DV-2T型黏度計,美國Brookfield公司;Rheolaser Master微流變儀,法國Formulaction公司;TA-XT plus質構測試儀、A/BE質構儀探頭,英國SMS公司;SW-CJ-2FD潔凈工作臺,蘇州蘇凈集團;SRH60-70型高壓均質機,上海申鹿均質機有限公司;立式低速離心機,德國Eppendorf公司;HG-50高壓滅菌鍋,日本HIRAYAMA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 攪拌型發酵乳樣品的制備

將牛奶預熱到60 ℃,按照白砂糖6.5%(質量分數)、牛乳93.5%(質量分數)比例加入白砂糖;加熱到65 ℃,以1 000 r/min轉速,化料15 min;20 MPa下均質;90 ℃加熱10 min滅菌;冷卻至37 ℃后于無菌操作臺內接種菌劑,樣品分組如表1所示。將接種后樣品置于42 ℃恒溫發酵直至pH值降到4.50達到發酵終點,置于冰水浴冷卻后無菌分裝于藍蓋瓶中;將達到發酵終點樣品置于4 ℃后熟24 h;將后熟樣品置于10 ℃貯藏28 d。發酵期間每2 h取1次樣品,貯藏期間每7 d取1次樣進行各指標測定。

表1 試驗分組Table 1 Experiment grouping

1.2.2 發酵乳流變特性的測定

取各組接種后發酵乳樣品20 mL于Rheolaser Master微流變儀器專用玻璃管中,保證玻璃管壁清潔,以免造成誤差。將玻璃管置于儀器測定槽內,將儀器溫度設置為42 ℃,每60 s測定1次樣品直至發酵結束[10]。通過微流變儀器配套軟件直接得到微觀黏性因子(macroscopic viscosity index,MVI)、固液平衡值(solid liquid balance,SLB)、彈性因子(elastic index,EI)和流動因子(fluidity index,FI)數據。

1.2.3 發酵乳pH及滴定酸度的測定

將發酵乳放置室溫后直接用pH計進行測定,每個樣品測定3組平行。滴定酸度(titratable acidity,TA)測定發酵乳中總酸含量,吉爾涅爾度(°T)為100 mL發酵乳消耗0.1 mol/L NaOH溶液的體積(mL)。滴定酸度測定依據GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》,取10 g發酵乳于錐形瓶中,加入20 mL蒸餾水,搖勻后加入3滴0.5%的酚酞指示劑,使用經過標定的0.1 mol/L NaOH溶液進行滴定,一邊滴加NaOH溶液一邊搖動錐形瓶,當樣品變為淺粉紅色并保持30 s內不褪色即為滴定終點,每組樣品測定3組平行。

1.2.4 發酵乳持水性的測定

取空三角燒瓶并稱重,稱取發酵乳樣品20 g于放有濾紙的漏斗中置于三角燒瓶上,于室溫下放置2 h 后收集濾液并稱重,每組發酵乳樣品測定3個平行[11],計算如公式(1)所示:

(1)

1.2.5 發酵乳中活菌數的測定

發酵乳中活菌數測定依據GB 4789.18—2010《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳與乳制品檢驗》,取發酵乳樣品15 g于加有玻璃珠的滅菌藍蓋瓶中,加入滅菌生理鹽水135 g,充分搖勻后梯度稀釋。采用平板傾注法計數,吸取稀釋后不同梯度的菌液1 mL于平板中,加入含有10 mg/L萬古霉素的MRS瓊脂培養基并搖勻,待培養基凝固后置于37 ℃培養箱厭氧培養72 h后計數。

1.2.6 發酵乳黏度的測定

將發酵乳放置室溫后,采用Brookfield DV-2T黏度儀進行測定,測定時選擇4#轉子,轉速100 r/min,扭矩10%～100%,測定時間30 s,每組樣品于不同位置測定3次平行[12]。

1.2.7 發酵乳質構的測定

采用TA-XT plus質構測試儀,A/BE探頭,將恢復到室溫的樣品放入樣品杯中,通過5 kg稱重傳感器進行單次壓縮循環試驗來對發酵乳樣品的硬度、稠度、內聚性和黏度指數,測試中速1.0 mm/s, 測試后速1.5 mm/s,初始應力2.0 g,壓縮程度20%,壓縮時間5 s,測試距離20 mm,每個樣品測定3次平行[12-13]。

1.2.8 數據分析

本文章中數據表示為“平均值±標準差”,使用軟件SPSS 19.0對數據進行顯著性分析,采用t檢驗。使用軟件Origin 2019繪制數據圖。

2 結果與分析

2.1 發酵乳活菌數的變化

添加副干酪乳酪桿菌PC-01各組發酵乳在發酵過程及貯藏期間發酵乳中PC-01活菌數變化情況如圖1所示。在整個發酵及貯藏期間,各組樣品中PC-01活菌數持續上升。PC-01低、中、高劑量組在發酵開始時添加量分別為(6.27±0.022)、(6.74±0.027)、(7.008±0.004) lg CFU/mL。在貯藏第28天,低、中、高劑量組發酵乳中PC-01活菌數分別上升到(7.84±0.010)、(8.13±0.013)、(8.22±0.004) lg CFU/mL。各組發酵乳樣品在貯藏期間PC-01活菌數均上升了一個數量級,且滿足國標及相關法規要求,活菌數始終高于1×106CFU/g。結果表明,該菌株在發酵乳中有著良好的活力及耐酸性,能在pH值相對較低的環境下保持活菌數穩定增長。這也與劉凱龍等[14]、苗壯壯等[15]對該菌株的研究相一致。本研究表明,菌株PC-01添加于發酵乳中,活菌數穩定增長,可以充分保證其在產品中相關功效的發揮。

圖1 發酵及貯藏過程中PC-01活菌數的變化Fig.1 Viable counts of PC-01 during fermentation and storage

2.2 發酵乳酸度的變化

pH值和滴定酸度是評價發酵乳的重要指標,對于益生菌發酵乳來說,它們不僅影響產品的口感和質量,對貯藏期間產品中益生菌的活菌數也有著重要影響。如圖2所示,發酵5.5 h時,各組發酵乳pH值均下降到4.5以下,到達發酵終點。到達發酵終點時,添加不同劑量副干酪乳酪桿菌PC-01的發酵乳與不添加PC-01發酵乳pH值及滴定酸度沒有顯著性差異(P>0.05)。在發酵乳貯藏期間,乳酸菌會繼續通過β-半乳糖甘酶分解發酵乳中乳糖產生乳酸,進而造成產品后酸化。相關研究表明,當發酵乳pH值保持在4.3～4.1時,產品擁有較高的質構及感官品質;當pH值下降到3.5左右時會導致乳清析出較多且產品口感過酸。因此,產品后酸程度是判定菌株是否適宜應用于發酵乳中的重要指標[16]。如圖2所示,各組發酵在貯藏期間pH值由4.3下降到4.0左右,變化不明顯,且組之間沒有顯著性差異(P>0.05)。各組發酵乳到達發酵終點時平均滴定酸度在82.5～83.5 °T,酸度適中。在10 ℃貯藏期間,發酵乳滴定酸度隨貯藏時間的增加逐漸上升,最終穩定在120 °T左右,各組之間無顯著性差異(P>0.05)。本研究表明,添加不同劑量PC-01對發酵乳到達發酵終點的時間以及發酵乳在貯藏期間的pH值及滴定酸度沒有顯著性影響,PC-01對發酵乳酸度變化起著非決定性作用,其添加不會增加產品的后酸化程度,這可能是由于該菌株利用糖類產生胞外多糖而非有機酸[17-18]。

圖2 發酵及貯藏過程中pH和滴定酸度的變化Fig.2 Changes of pH and TA during fermentation and storage

2.3 發酵期間發酵乳的微觀流變學特征

2.3.1 微觀黏性因子

MVI與黏性模量呈正比,反映的是樣品的微觀黏性特征,可以體現發酵乳黏度隨時間的變化情況[19]。如圖3所示,從發酵開始到2.5 h左右,酪蛋白還未形成交聯的網狀凝膠結構,各組樣品的黏度始終保持在一較低水平范圍波動。在發酵2.5 h后,添加不同劑量PC-01的3組發酵乳的MVI值開始直線上升,這是由于隨著pH下降,酪蛋白膠束開始瓦解,酪蛋白重排開始形成凝膠結構[20]。發酵劑對照組相較添加益生菌各組MVI值開始上升時間略晚,說明添加PC-01可以加快凝膠結構的形成速度。此后,各組發酵乳MVI值迅速上升至最大值,樣品進入高黏階段,并在4 h左右進入穩定狀態,此后各組發酵乳MVI值之間無顯著性差異。根據MVI值結果可以得到,PC-01的添加可以加快產黏速度,但對最終產品的微觀黏性無顯著影響(P>0.05)。苗壯壯等[15]研究也得到相似的結果,益生菌的添加對發酵乳MVI值無顯著性影響。

圖3 發酵過程中黏性因子的變化Fig.3 Changes of MVI during fermentation

2.3.2 固液平衡值

SLB反映的是不同時間樣品中固體性質和液體性質的比率,固液平衡曲線斜率越小代表粒子的移動速度越小,說明此時產品更加接近固體狀態。當0

圖4 發酵過程中固液平衡值的變化Fig.4 Changes of SLB during fermentation

2.3.3 彈性因子

EI與彈性模量成正比,可以直接反應樣品彈性隨時間的變化情況。EI值越大說明發酵乳的凝膠彈性越大,發酵乳樣品越穩定[17]。發酵過程各組樣品彈性因子變化如圖5所示,發酵乳樣品的EI值在初始的前2.5 h內保持穩定。在2.5 h后,添加副干酪乳酪桿菌PC-01各組發酵乳EI值率先上升,到達凝膠點。發酵劑對照組出現拐點時間相較其他各組較晚。各組發酵乳EI值均在發酵4 h后到達穩定狀態,說明樣品形成穩定的凝膠結構。可以看出在發酵結束時,隨著PC-01接種量的增多,樣品EI值下降越明顯,這說明發酵乳在添加益生菌后,在一定程度上降低了樣品的彈性,且彈性下降程度與益生菌的接種量有關,這也與苗壯壯等[15]的研究結果相一致。

圖5 發酵過程中彈性因子的變化Fig.5 Changes of EI during fermentation

2.3.4 流動因子

FI反映的是粒子在乳液中運動速度的快慢,FI值越大代表此時樣品中微觀粒子運動速度越快,樣品的流動性越強。如圖6所示,發酵開始的前2.5 h,各組樣品的FI值在高水平波動,說明此時樣品仍處于液體狀態,微觀粒子高速運動。在此階段,樣品的MVI值和SLB也處于波動狀態,因為酪蛋白還未形成網狀的凝膠結構,樣品表現為高流動,低黏度和低彈性的不穩定狀態[20]。2.5 h后,添加PC-01的各組發酵乳率先到達拐點,FI值直線下降。之后對照組樣品也呈現相同的趨勢。各組FI值均在4 h后進入穩定狀態,在發酵結束時各組發酵乳FI值間無顯著性差異(P>0.05)。

圖6 發酵過程中流動因子的變化Fig.6 Changes of FI during fermentation

微流變的結果表明,4組發酵乳均在2.5 h左右開始凝乳,并在4 h后基本到達穩定狀態。同時,副干酪乳酪桿菌PC-01的添加會將凝乳時間點提前,但是在發酵結束時隨著PC-01添加量的增多樣品的凝膠強度與穩定性有所下降,并且提高了發酵乳中液體性質的比率,這與蔡淼等[21]的研究結果相一致。

2.4 發酵乳黏度的變化

黏度是反映發酵乳品質的關鍵指標,適宜的黏度能給發酵乳帶來良好的組織狀態和感官品質。各組發酵乳在貯藏期間黏度變化如圖7所示,整體上看,各組發酵乳在貯藏期間黏度呈現先上升后下降的趨勢。其中,添加PC-01組發酵乳樣品起始黏度相較發酵劑對照組較低,且隨著副干酪乳酪桿菌PC-01添加量的增加,發酵乳的起始黏度降低,這一結果與微流變中彈性因子相一致。PC-01-L和PC-01-M兩組發酵乳在整個貯藏期間黏度相對穩定,而PC-01-H組的發酵乳在前14 d黏度始終處于上升狀態,在貯藏結束時黏度最高。發酵劑YF-L904對照組起始黏度較高,但在貯藏期間下降明顯,在貯藏14 d后黏度顯著低于其他各組(P<0.05)。添加中低劑量的副干酪乳酪桿菌PC-01可以保持發酵乳黏度的穩定性,而添加高劑量PC-01則可以在貯藏后期顯著提高發酵乳的黏度。說明益生菌PC-01對發酵乳黏度的影響情況與添加量有關,并且相較于對照組,可以在貯藏期間使發酵乳處于一個更穩定的狀態。

圖7 貯藏過程中發酵乳黏度的變化Fig.7 Viscosity of fermentation milk during storage

2.5 發酵乳持水性的變化

發酵乳的持水性與產品的組織狀態和穩定性都密切相關,持水性強說明發酵乳組織狀態良好,凝膠結構穩定,乳清析出較少。隨著貯藏期間發酵乳pH值的降低,會導致乳清析出,造成持水力下降。如圖8 所示,4組樣品在10 ℃貯藏期間,持水性都保持在一個相對穩定的區間內波動,無明顯下降,這一結果也與各組發酵乳在貯藏期間pH值的變化情況相一致。隨著貯藏時間的增長,各組發酵乳持水性之間差異減小,在第28天,各組發酵乳持水性之間無顯著性差異。

圖8 貯藏過程中發酵乳持水力的變化Fig.8 Water capacity of fermented milk during storage注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.6 發酵乳持水性的變化

發酵乳的質構特征包含硬度,稠度,內聚性和黏度指數。硬度是指壓縮過程中的最大受力點,即在壓縮至20 mm時測量。硬度是決定酸奶質量的關鍵性指標,根據研究表明,發酵乳的硬度與選用的發酵劑以及牛奶中的干物質含量、蛋白質組成和含量都高度相關。稠度是指向下壓縮至最大受力點時的正面積,稠度越高代表樣品的黏度越大。稠度與原奶中蛋白質的含量有關,蛋白質含量越高,發酵乳往往稠度更高更穩定。內聚性是指探頭向上返回時負向力的最大值,內聚性是膠體結構結合強度的標志,它反映了酸奶結構的完整性,與內部的凝膠強度正相關。黏度指數是指探頭向上返回時圖中負值區域的面積,利用產胞外多糖的菌株做發酵劑往往可以提高發酵乳的黏度指數[17,22-23]。

發酵乳的質構受到多種因素的影響,除了牛乳中蛋白質和脂肪的含量外,還受到發酵劑的種類及添加量,發酵條件和貯藏時間等多種因素影響。如表2～表5所示,在5.5 h時各組發酵乳質構指標與彈性因子和黏度相一致,隨著PC-01添加量的增加而下降。在貯藏期間,添加中、低劑量PC-01兩組發酵乳與對照組質構變化趨勢相一致,這3組發酵乳的硬度、稠度、內聚性和黏度指數在前14 d呈現上升趨勢,在14 d后大幅度下降,且在貯藏14 d后3組之間無顯著性差異,這也與潘瀟[13]的研究結果相一致。而PC-01-H組與其他3組之間質構差異較大,PC-01-H組發酵乳在貯藏開始時各項質構指標顯著低于其他各組,但在貯藏期間各質構指標變化幅度較小,保持在一個相對較為穩定的狀態。

表2 貯藏期間發酵乳硬度的變化Table 2 Firmness of fermented milk during storage

表3 貯藏期間發酵乳稠度的變化Table 3 Consistency of fermented milk during storage

表5 貯藏期間發酵乳黏度指數的變化Table 5 Viscosity index of fermented milk during storage

為了更好的了解PC-01的添加及貯藏時間對發酵乳質構的綜合影響,分別按樣品分組和按時間分組對質構進行了進一步分析。

如圖9所示,通過對商業化發酵劑直接發酵和添加PC-01發酵乳做主成分分析及聚類分析可以得到,4組發酵乳中,添加中、低劑量益生菌PC-01組發酵乳在質構上更為相近,PC-01-H組發酵乳在質構上與其他3組存在顯著性差異。結果表明副干酪乳酪桿菌的添加會對發酵乳質構產生影響,且其對質構的影響程度與添加量有關。

a-主成分分析;b-聚類分析圖9 根據分組對發酵乳質構進行主成分分析和聚類分析Fig.9 PCA analysis and clustering analysis of fermented milk texture based on group

將發酵乳樣品按照發酵及貯藏時間分組,對4組發酵乳進行主成分分析及聚類分析。如圖10所示,在質構方面,后熟后(1 d)的樣品與貯藏7 d的樣品質構更為相似;貯藏21 d和貯藏28 d樣品相似。且前14 d的樣品整體上更為相近,與貯藏21、28 d樣品之間存在顯著性差異。由此可見,貯藏時間對發酵乳的質構有著顯著影響。

a-主成分分析;b-聚類分析圖10 根據時間對發酵乳質構進行主成分分析和聚類分析Fig.10 PCA and clustering analysis of fermented milk texture based on storage time

3 結論與討論

副干酪乳酪桿菌因其多樣的益生特性而被越來越多應用于功能性乳制品的制備中。當益生菌作為共發酵菌株用于乳制品的開發時,更重要的是考慮它們對產品質量、特性和消費者喜愛度的影響。本試驗以副干酪乳酪桿菌PC-01為共發酵菌株,在先前的研究中發現,該菌株具有良好的消化液耐受性、單菌株發酵能力,同時在以5×106CFU/g的起始添加量與商業化發酵劑復配時擁有最優的感官特性。本試驗研究了不同起始添加量的PC-01與商業化發酵劑復配對發酵乳理化特性、微觀流變學特性和質構特性的影響。旨在更加綜合、全面比較不同添加劑量對發酵乳產品特性的影響,確定該菌株在發酵乳中的最適添加劑量。

試驗結果表明,添加不同劑量副干酪乳酪桿菌PC-01不會對發酵及貯藏期間發酵乳的pH及滴定酸度帶來顯著性影響,不會加劇產品的后酸化,且PC-01活菌數保持持續穩定增長。在發酵過程中,相較于YF-L904對照組,添加不同劑量PC-01的發酵乳開始凝乳時間略有提前,且隨著PC-01的增加,發酵結束時產品的彈性因子呈現下降趨勢。在貯藏期間,副干酪乳酪桿菌PC-01的添加有助于維持產品的黏度,各組發酵乳持水力均在一個穩定的范圍內波動。在質構方面,除PC-01-H組外其他3組在貯藏期間質構變化趨勢相一致,且在貯藏14 d后質構特性無顯著性差異。

綜上所述,副干酪乳酪桿菌PC-01在起始添加量為5×106CFU/g(PC-01-M)時,不僅可以提高產品感官。同時,能在不改變產品基本特征的情況下提高產品在貯藏期間的穩定性,并保持活菌數,適合復配于發酵乳中。