發芽對小麥苗酚類物質及抗氧化能力的影響

馬燕,王婧,程永霞,喬明武,宋蓮軍,黃現青*,劉星凱,屈玲玉,王世銘

1(河南農業大學 食品科學技術學院,河南 鄭州,450002)2(河南省食品加工與流通安全控制工程技術研究中心,河南 鄭州,450002)

酚類物質合成以苯丙烷代謝途徑為主,其合成途徑為:由L-苯丙氨酸經苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia lyase, PAL)脫氨基,形成反式肉桂酸,在肉桂酸-4-羥化酶(cinnamic acid 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid:CoA ligase, 4CL)等作用下生成黃酮類、酚酸和花色苷類等酚類物質[9]。谷物籽粒萌發時生理生化過程得以調控,物質代謝流向改變,酚類物質呈現動態變化。以往關于小麥中酚類物質的研究主要集中于不同品種原料籽粒及組織部位中含量變化,關注點更多在于對酚類物質變化結果的分析,而對于發芽過程中小麥酚類物質及其合成途徑中關鍵酶活力、抗氧化能力的動態變化還缺乏系統研究。基于此,本研究以大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個品種小麥為研究對象,探討在不同發芽階段下,小麥苗總酚含量、酚類物質合成關鍵酶PAL、C4H、4CL活力及抗氧化能力的變化,為研發谷物芽苗健康食品提供科學依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥:品種為大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307購自河南省秋樂種業科技有限公司,2020年收獲,置于-20 ℃下保存。

培養條件:稱取經過挑選、除雜后的小麥籽粒,用0.5%(體積分數)的NaClO溶液以料液比1：5(g：mL)消毒15 min,用去離子水浸泡6 h。然后將小麥籽粒均勻放置于有自動噴淋裝置的小型發芽機中進行發芽,發芽機置于濕度80%,25 ℃的恒溫培養箱中。采用LED白光照射,每天照射12 h。分別在第2、4、6天取樣(0 d為原料種子),用于后續指標檢測。

甲醇和乙酸乙酯,廣東光華科技股份有限公司;福林酚、DPPH、ABTS、Trolox、沒食子酸,Sigma-Aldrich公司;鹽酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、抗壞血酸,國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

MS-04SU型磁力攪拌器,蘇州捷美電子有限公司;WH-861型渦旋器,太倉市華利達實驗設備有限公司;UV-5100B型紫外可見分光光度計,上海元析儀器有限公司;MS-04SU型磁力攪拌器,蘇州捷美電子有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 生長狀況測定

隨機選取30株小麥芽苗,測定其芽長/根長,取其平均值,結果表示為mm/株。隨機選取100株小麥芽苗,測定其鮮重/干重,取其平均值,結果表示為g/100株。

1.3.2 游離和結合酚類物質提取

游離和結合酚類化合物提取方法在MA等[10]方法的基礎上作適當的修改。將小麥苗冷凍干燥、粉碎并過60目的篩網后,取小麥苗粉1 g,加20 mL 80%(體積分數)甲醇,于試管架上手搖10 min,然后在10 000×g,4 ℃條件下離心10 min,重復此操作3次并把離心后的提取液合并旋轉蒸發至干,定容后作為游離酚提取液。提取游離酚后的沉淀物加入2 mol/L NaOH后避光振蕩水解4 h,然后將得到的水解液調整pH值為1.8,乙酸乙酯與水解液充分混合后離心10 min,取上層乙酸乙酯層,重復此操作3次后合并乙酸乙酯層旋轉蒸發至干,定容后作為結合酚提取液。

1.3.3 總酚含量

總酚含量的測定參照CHEN等[8]的方法。以沒食子酸作為標準品,通過標準曲線計算總酚含量,總酚含量用mg GAE(gallic acid equivalents)/100 g DW(dry weight)表示。

1.3.4 PAL活力

PAL的提取與測定參照ASSIS等[11]的方法。取小麥苗,以料液比1：10(g：mL)加入預冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入硼砂緩沖液、L-苯丙氨酸溶液,于37 ℃ 保溫60 min,在290 nm下測定吸光值。以每小時每克小麥苗(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01 為一個PAL活力單位(U),表示為0.01ΔOD290/(h·g FW),即U/g FW(fresh weight)。

1.3.5 C4H活力

C4H的提取與測定參照HAN等[12]的方法。取小麥苗,以料液比1：10加入預冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入磷酸緩沖液、肉桂酸、NADPH,于30 ℃保溫20 min,在340 nm下測定吸光值。以每分鐘每克小麥苗(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01為一個C4H活力單位(U),表示為0.01ΔOD340/(min·g FW),即U/g FW(fresh weight)。

1.3.6 4CL活力

4CL的提取與測定參照HAN等[12]的方法。取小麥苗,以料液比1：10加入預冷的緩沖液,研磨離心后取上清液加入MgCl2、ATP、CoA、對香豆酸,于40 ℃保溫10 min,在333 nm下測定吸光值。以每分鐘每克小麥苗(鮮重)酶促反應體系吸光度值增加0.01為一個4CL活力單位(U),表示為0.01ΔOD 333/min·g FW,即U/g FW(fresh weight)。

1.3.7 ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力

ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力的測定參照MA等[10]的方法。以Trolox配制標準曲線,ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力以μmol TE/g DW(dry weight)計。

1.4 數據處理和統計分析

設計3次生物學重復實驗,結果以平均值(means)±標準偏差(SD)表示。數據采用SPASS 20.0進行統計分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 發芽對小麥苗生長狀況的影響

隨著發芽時間的延長,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個品種小麥的芽長、根長和鮮重均呈增加趨勢(圖1-A～圖1-C),而干重則下降(圖1-D)。其中芽長在發芽前期增加幅度較大,4 d時5個品種小麥的芽長均是2 d的3倍以上,而發芽6 d時5個品種小麥的芽長則是4 d的1.5～2.0倍。秋樂168和鄭麥163在發芽全程保持較高的長勢。鮮重的變化趨勢與芽長變化一致,也是在發芽前期的增長幅度大于后期。5個品種小麥的根長和干重則在整個發芽期間保持相對穩定的變化速率。

A-芽長; B-根長; C-鮮重;D-干重圖1 不同小麥品種發芽期間生長狀況變化Fig.1 Changes of growth status in different wheat varieties during germination注: 不同小寫字母表示在同一發芽時間下不同品種間差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 發芽對小麥苗總酚含量的影響

隨著發芽時間的延長,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個品種小麥的游離酚含量、結合酚和總酚含量均呈增加趨勢(圖2)。發芽2 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種游離酚含量分別較未發芽種子增加92%、51%、52%、86%和111%;發芽4 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種游離酚含量分別較發芽2 d時增加68%、50%、81%、37%和51%,其中秋樂168小麥苗的游離酚含量為193 mg GAE/100 g DW,顯著高于其他品種(P<0.05),秋樂6號小麥苗的游離酚含量最低;發芽6 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種游離酚含量分別較第4天時增加88%、84%、54%、110%和120%,游離酚增幅最大的為百農307,其次為鄭麥163、秋樂168,增幅最小的為秋樂6號。由于百農307和鄭麥163游離酚增幅較大,到第6天時,二者含量已和秋樂168接近,均顯著高于另外2個品種(P<0.05)。對于結合酚而言,5個小麥品種中秋樂168具有最高的結合酚含量,且均顯著高于其他品種,秋樂6號次之,百農307含量最低。與發芽第4天相比,5個品種小麥結合酚含量分別增加48%、43%、34%、110%和120%,其漲幅變化與游離酚變化基本一致。發芽過程中隨著游離酚和結合酚含量的提高,小麥苗的總酚含量也大幅提高,秋樂168在發芽全程都具有最高的總酚含量。

A-游離酚; B-結合酚;C-總酚圖2 不同小麥品種發芽期間總酚含量變化Fig.2 Changes of phenolics contents in different wheat varieties during germination

2.3 發芽過程小麥苗游離和結合酚比例變化

如圖3所示,發芽過程中游離酚占總酚含量的比值呈上升趨勢,但是不同品種之間差異較大,未發芽時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307游離酚占總酚含量的比值分別為31%、29%、32%、38%和38%;第2天時5個小麥品種游離酚占總酚含量的比值分別為33%、30%、34%、40%和41%;發芽第4天時,游離酚占總酚含量的比值分別為34%、31%、37%、43%和44%;第6天時其比值變為39%、34%、40%、44%和45%。結果顯示,發芽使小麥苗中游離和結合酚類物質的比例發生了較大變化,進一步改善了小麥的功能品質。

A-0 d; B-2 d; C-4 d;D-6 d圖3 不同小麥品種發芽期間游離酚類和結合酚類物質比例變化Fig.3 Changes in the proportion of free and bound phenols in different wheat varieties during germination

2.4 發芽對小麥苗PAL、C4H和4CL活力的影響

PAL是苯丙烷代謝途徑的第一步酶,也是重要的限速酶。如圖4-A所示,隨著發芽時間的延長,5個品種小麥苗的PAL活力均先增加后下降的趨勢。發芽全程,秋樂168號小麥苗中PAL活力最高,顯著高于其他4個品種(P<0.05),百農307的PAL活力最低。如圖4-B所示,隨著發芽時間的延長,5個品種的小麥苗C4H活力均呈上升趨勢,發芽4 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種C4H活力分別較發芽2 d增加47%、20%、45%、75%和48%;發芽6 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種C4H活力分別較第4天時增加79%、81%、43%、2%和21%,品種間變化差異較大。4CL活力變化與PAL變化趨勢一致,也是隨著發芽時間的延長活力均先增加后下降的趨勢(圖4-C),但各個品種間差異較大。發芽2 d和4 d時,鄭麥163活力顯著高于其余4個品種;發芽6 d時,鄭麥163小麥苗4CL活力與秋樂6之間無顯著差異。

A-PAL; B-C4H; C-4CL圖4 不同小麥品種發芽期間PAL、C4H和4CL變化Fig.4 Changes of PAL, C4H and 4CL during germination of different wheat varieties

2.5 發芽對小麥苗抗氧化能力的影響

由圖5看出小麥苗的抗氧化能力隨著發芽時間的延長而增加,游離態和結合態總酚的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均提高。發芽2 d時,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較未發芽種子增加60%、42%、47%、84%和104%,DPPH自由基清除能力分別較未發芽種子增加60%、47%、48%、72%和90%;發芽4 d時,5個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較未發芽種子增加57%、57%、59%、25%和33%,DPPH自由基清除能力分別較第2天增加58%、52%、76%、41%和45%;發芽6 d時,5個小麥品種小麥苗總酚的ABTS陽離子自由基清除能力分別較第4天增加47%、35%、27%、70%和93%,DPPH自由基清除能力分別較未發芽種子增加56%、47%、20%、72%和90%。整體看來,小麥苗ABTS陽離子自由基清除能力和DPPH自由基清除能力變化趨勢較為一致。

A-游離ABTS陽離子自由基; B-結合ABTS陽離子自由基; C-總ABTS陽離子自由基;D-游離DPPH自由基;B-E-結合DPPH自由基;F-總DPPH自由基圖5 不同小麥品種發芽期間抗氧化能力變化Fig.5 Changes of antioxidant capacity of different wheat varieties during germination

2.6 小麥苗酚類物質和抗氧化能力相關性分析

對小麥苗酚類物質和抗氧化能力進行相關性分析。由表1可知,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種在不同生長階段的總酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力均在0.01水平上均呈現顯著正相關。秋樂168在不同生長階段的總酚含量與DPPH自由基清除能力在0.05水平上均呈現顯著正相關,其余4個品種的麥苗在不同生長階段的總酚含量與ABTS陽離子自由基清除能力均在0.01水平上均呈現顯著正相關。

表1 小麥苗酚類物質和抗氧化能力相關性分析Table 1 Correlation analysis between phenols and antioxidant capacity of Wheat Seedlings

3 討論

本研究中,大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個小麥品種的芽長、根長和鮮重隨著發芽時間的延長而增加(圖1)。小麥芽苗在不同萌發階段的生長情況不同,在本研究的3個發芽階段(0～2 d、2～4 d、4～6 d)中小麥苗生長表現出典型的“慢-快-慢”趨勢:0～2 d發芽減慢,2～4 d發芽加快,4～6 d發芽減慢,這與ZHOU等[13]的研究結果相似。谷物發芽時,直鏈淀粉和支鏈淀粉水解成單糖,貯藏蛋白水解成肽和氨基酸,因而干重下降,植酸酶活性增加降解多余植酸鹽,從而提高了營養物質的生物利用率[14]。與此同時,發芽使得谷物中γ-氨基丁酸、類黃酮和酚酸等生理活性成分含量增加,谷物抗氧化、抗菌消炎、免疫力調節等功效增強,營養價值和保健功能得到提升。本研究比較了不同品種小麥籽粒中游離、結合及總酚含量,結果表明發芽能夠顯著提高小麥的酚類物質含量(圖2),這與前人研究結果一致[15-16]。谷物中的多酚類化合物包括酚酸、花青素、醌類、黃酮醇、查耳酮、黃酮、黃烷酮類等[17],酚類物質一部分以游離態存在,另一部分與蛋白質、木聚糖、纖維素和半纖維素等結合存在于植物的細胞壁中[18]。以往關于酚類物質的研究對象主要為蔬菜和水果,對于谷物中酚類物質的研究有限,由于酚類物質提取和純化工藝的進步,使得谷物中大量結合態酚類物質(酚酸)被發現,結合酚的抗氧化能力也陸續得到證實,谷物的營養價值被重新認定,成為膳食多酚的重要來源之一。值得注意的是,本研究特別關注了小麥發芽期間游離和結合總酚比例的變化,發現發芽過程中游離酚占總酚含量的比值呈上升趨勢(圖3),這與他人研究中小麥等谷物游離態酚類物質含量增加結論明顯一致,可能是由于發芽期間籽粒生命活動增強,苯丙烷代謝途徑被激活,相關酶的活動使得與細胞壁等結構結合的酚類物質釋放出來[6]。

酚類物質含量的增加與酚類物質合成途徑的關鍵酶活力變化有關,目前關于植物食品原料中酚類物質的研究主要集中于游離態、酯化和結合態酚酸的提取和純化工藝[19],酚類物質組分及含量的分析[8,20]以及生理活性[21-22]等方面。對于酚類物質合成關鍵酶活力關注較少,對于酶活力與酚類物質含量相關性分析研究尚淺。PAL在植物次生代謝過程中有重要作用,迄今為止,已證實PAL參與花青素積累、木質化、黃酮類物質合成以及病蟲害防御等多種生理過程[23]。PAL是苯丙烷代謝途徑的限速酶,其活力對酚類物質的形成速率有重要影響。本研究中,發芽前期,PAL的變化趨勢與5個品種小麥苗的總酚含量變化趨勢一致,均是隨著發芽時間的延長而持續提高,這是酚類物質積累的直接原因,發芽后期PAL酶活力下降,但酚類物質持續增加,這可能是因為酶活力呈動態變化,而取樣時間點有限,此外,PAL活力雖然有所下降,但仍高于發芽初期,這也使得酚類物質持續積累,含量增加。在不同發芽階段,5個品種小麥苗酚類物質含量與PAL酶活均呈顯著或極顯著正相關(P<0.05或P<0.01),其中秋樂168PAL酶活最強,其也具有最高的酚類物質含量。C4H在植物組織中具有很高的活性,是黃酮類物質合成的關鍵酶[24],本研究中,C4H與5個品種小麥苗的總酚含量在發芽全過程變化一致,都是隨著發芽時間的延長而增加。4CL于1976年由MANSELL等首次從嫩柳枝中提取,4CL酶處在苯丙烷類代謝中合成特定產物的轉折點上,其可生成綠原酸、羥基肉桂酸等酚酸類物質,也可以作為重要的前體物質介入類黃酮代謝[9]。發芽全過程4CL的變化趨勢與PAL較為一致,在發芽前期增加,后期略有下降,不同品種間表現出一致性(圖4)。在發芽前期階段(2 d,4 d),5個品種小麥苗酚類物質含量與C4H和4CL酶活相關性較弱,但在發芽后期(6 d)酚類物質含量與C4H和4CL酶活表現出較強正相關。

大量研究表明,酚類物質通常被認為是對人體健康有益的一類生物活性物質,主要是因為它們具有較強的抗氧化活性。本研究采用ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力評價小麥苗的抗氧化能力,這2種評價方法都是基于電子轉移并涉及有色氧化劑還原,目前已被廣泛用來評價谷物及果蔬的抗氧化能力。研究結果表明小麥苗的抗氧化能力隨著發芽時間的延長而增加,游離態和結合態總酚的ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均提高(圖5)。對小麥苗酚類物質和抗氧化能力進行相關性分析發現,不同生長階段麥苗的總酚含量與ABTS陽離子自由基和DPPH自由基清除能力均呈現極顯著正相關(表1),說明酚類物質的積累是提高抗氧化能力的重要條件。

本研究分析了不同品種小麥苗發芽過程中酚類含量、酚類合成關鍵酶活力以及抗氧化能力的變化,可為小麥苗產品開發提供一定理論基礎。總所周知,酚類物質種類眾多,包括酚酸、黃酮、縮合單寧、木脂素等幾大類8 000多種物質,且在不同原料中的含量和種類差異較大,基于此,后續工作應加強對小麥苗酚類物質鑒定分析,深入研究小麥苗發芽過程酚類物質的組成、存在形式及含量變化,系統性構建小麥苗發芽過程酚類物質變化圖譜。

4 結論

谷物營養價值高,富含膳食纖維、維生素和礦物質,發芽可提高谷物中各營養元素的含量,且可顯著提高籽粒生物活性成分,賦予其更多生理活性功能,用來開發功能食品。本研究聚焦于發芽對大平原1號、秋樂6號、秋樂168、鄭麥163和百農307五個品種小麥苗酚類物質形成及抗氧化能力的影響,結果表明,發芽激活了小麥苗酚類物質合成關鍵酶,隨著發芽時間的延長小麥苗酚類物質顯著增加,抗氧化能力顯著增強。該研究結果可為小麥深加工提供新思路,為開發富含酚類物質等其他功能成分的谷物食品奠定理論基礎,對促進國民經濟和社會發展有重要意義。