石榴皮中纖維素納米晶體的提取與表征

謝大明,張茂棲,涂倩,簡玉英,楊育靜,黃茂薇,包沅鑫,曾珍,李誠*

1(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625000)2(資中縣市場監(jiān)管局,四川 內(nèi)江,641200)

石榴皮是石榴取籽后的農(nóng)副產(chǎn)品,被大量丟棄,既造成了環(huán)境污染也造成了資源浪費(fèi)。為解決此問題,國內(nèi)外學(xué)者就石榴副產(chǎn)物進(jìn)行了大量研究,其中包括了從石榴皮中提取石榴多酚[1]、石榴黃酮[2]、果膠[3]、色素[4]等研究。但未見從石榴皮中提取石榴皮纖維素納米晶體(pomegranate peel cellulose nanocrystals,PCNC)的相關(guān)研究報(bào)道。

纖維素納米晶體是具有高結(jié)晶度的棒狀納米粒子。主要制備方法有蒸汽爆破法、高壓均質(zhì)法、超聲波技術(shù)、酸/堿水解和酶輔助水解[5]。纖維素納米晶體的提取步驟主要包括2個(gè)部分,首先是對植物材料進(jìn)行堿處理和漂白,以去除材料中的木質(zhì)素、半纖維素、蠟和油等成分得到纖維素。最后是使用物理或化學(xué)等方法使纖維素尺寸縮小,成為纖維素納米晶體。纖維素納米晶體具有觸變性,當(dāng)添加到流體食品中時(shí),可以提供出色的加工和貯存性能,含有纖維素納米晶體的流體具有剪切稀化性,隨著發(fā)生剪切而降低黏度,使流體更容易進(jìn)行機(jī)械加工,在流體貯存期間,纖維素納米晶體也可作為穩(wěn)定劑[6];纖維素納米晶體具有高度有序的結(jié)構(gòu),可改善膜的機(jī)械性能,本身無毒。將其加入到可食膜中,可增強(qiáng)其水蒸氣阻隔性和抗菌性能[7]。因此,從石榴皮中提取纖維素納米晶體在食品加工、貯藏、包裝等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

突尼斯軟籽石榴產(chǎn)自四川會理,采摘期為八月中旬;鹽酸(36%)、氫氧化鈉(塊狀)、次氯酸鈉、濃硫酸(95%)均為分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9245A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱,上海一恒科技有限公司;均質(zhì)機(jī),上海美譜達(dá)儀器有限公司;Q200MDSC差示掃描量熱儀,美國TA公司;Nano ZS馬爾文粒度儀,英國馬爾文儀器有限公司;X-射線衍射儀,荷蘭PANalytical公司;傅里葉紅外光譜儀,美國Thermo electron公司;掃描電子顯微鏡,日本日立公司;原子力顯微鏡,德國Bruker公司;熱重分析儀器,德國NETZSCH公司;真空冷凍干燥機(jī),美國SIM公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 石榴皮渣制備

手工剝離石榴皮,40 ℃烘箱干燥60 h,粉碎,過40目篩,貯藏備用。

1.3.2 石榴皮纖維素的制備[8]

取上述30 g石榴皮渣,加入300 mL蒸餾水,85 ℃攪拌30 min。然后加入300 mL 1 mol/L HCl, 85 ℃攪拌30 min,過濾,洗滌至中性。而后加入300 mL 100 g/L氫氧化鈉溶液,70 ℃攪拌160 min,過濾,洗滌至中性。最后用300 mL 1%(體積分?jǐn)?shù))次氯酸鈉溶液,95 ℃攪拌60 min,重復(fù)3次,直到濾渣被漂白,過濾,洗滌至中性。進(jìn)行真空冷凍干燥,得到石榴皮纖維素,密封袋中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 PCNC的制備

使用酸水解法提取纖維素納米晶體[9],稍作修改:取上述5 g石榴皮纖維素,加入75 mL 55%(體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液,50 ℃攪拌60 min。將所得溶液在4 000 r/min下離心10 min以除去硫酸,重復(fù)5次。從離心機(jī)中收集的沉淀物用超純水稀釋,在4 ℃條件下透析至中性。然后將纖維素納米晶體懸浮液以10 000 r/min的速度均質(zhì)處理3 min,獲得中性勻漿膠體懸浮液,冰浴超聲10 min。最后將懸浮液冷凍干燥成粉末,得到PCNC,4 ℃下密封貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 納米纖維素晶體表征

1.3.4.1 粒徑與Zeta電位測定

利用Nano ZS馬爾文粒度儀對納米纖維素晶體的粒徑和穩(wěn)定性進(jìn)行表征。配制0.1 mg/mL的纖維素納米晶體懸浮液,上機(jī)檢測(測試前超聲處理5 min)。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FTIR)測定

稱取1 mg納米纖維素晶體粉末和100 mg溴化鉀粉末于研缽中,研至均勻,取30 mg混合樣品壓制成片,在500～4 000 cm-1的紅外波段進(jìn)行測定得到其光譜。

1.3.4.3 X-射線衍射(X-ray diffraction,XRD)測定

取適量樣品,采用X-射線衍射儀進(jìn)行測定。操作條件為:銅靶,管壓30 kV,電流10 mA,步長0.05°,掃描速度0.05°/s,衍射角(2θ)掃描范圍為5°～80°。采用Segal公式[10]計(jì)算PCNC的結(jié)晶度指數(shù)(crystallinity index,CrI),如公式(1)所示:

(1)

式中:I002為002晶面(2θ=22°)衍射峰強(qiáng)度,即結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度;I18.5為2θ=18.5°處晶格衍射峰強(qiáng)度,即無定形區(qū)的衍射強(qiáng)度。

1.3.4.4 差示掃描量熱(differential scanning calorimetry,DSC)測定

取5 mg樣品加到坩堝中,以空坩堝作為對照。DSC測定程序?yàn)?氮?dú)庾鳛楸Ｗo(hù)氣,升溫速率25 ℃/min,溫度從30 ℃上升至400 ℃。

1.3.4.5 熱重分析(thermogravimetric analysis,TGA)測定

在氮?dú)鈼l件下以10 ℃/min的恒定加熱速率,記錄從30～600 ℃的熱重(thermogravimetric,TG)曲線和導(dǎo)數(shù)熱重(derivative thermogravimetric,DTG)曲線。

1.3.4.6 掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy,SEM)測定

將樣品置于帶有導(dǎo)電膠的樣品臺上,吹去多余樣品,經(jīng)離子濺射儀噴金30 s后,在加速電壓3.0 kV 的條件下進(jìn)行觀察并拍攝樣品形貌。

1.3.4.7 原子力顯微鏡(atomic force microscopy,AFM)測定

將一滴高度稀釋的懸浮液放在硅片基底上并使其風(fēng)干。使用Dimension Fast Scan型原子力顯微鏡進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與分析

2.1 粒徑與Zeta電位分析

使用Nano ZS馬爾文粒度儀對納米纖維素懸浮液的粒度大小和電位分布進(jìn)行分析,如圖1所示。其粒度主要分布區(qū)間為100～400 nm,表明大部分PCNC顆粒具有納米尺寸,與AFM所顯示的尺寸一致。但動態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)獲得的納米纖維素的粒徑值并不是絕對的,而是表觀粒徑。這是因?yàn)镈LS依賴于布朗運(yùn)動來監(jiān)測散射強(qiáng)度,并通過Stokes-Einstein根據(jù)擴(kuò)散率確定粒徑,方程依賴于假設(shè)的球形流體動力學(xué)的半徑值,并且擴(kuò)散系數(shù)是恒定的,對于棒狀的納米纖維素粒子來說并不恒定[11]。通過Zeta電位測定來確定PCNC懸浮液的穩(wěn)定性,其Zeta電位值為-38.6 mV。原因可能是PCNC在提取過程中時(shí),纖維素的無定形區(qū)域被H2SO4水解,一些表面羥基被硫酸基團(tuán)取代,從而讓顆粒帶負(fù)電。研究表明,Zeta 電位絕對值超過25 mV的納米纖維素懸浮液通常是穩(wěn)定的,而Zeta電位值在-15～15 mV的納米顆粒不穩(wěn)定,會發(fā)生絮凝現(xiàn)象[8]。MEHANNY等[12]進(jìn)行了納米纖維素的Zeta電位的研究實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)其值大多集中在18～60 mV。因此本試驗(yàn)制備的PCNC具有良好的穩(wěn)定性。

圖1 PCNC粒徑分布圖Fig.1 PCNC particle size distribution

2.2 傅里葉變換紅外光譜分析

FTIR光譜可表征石榴皮渣處理成PCNC而發(fā)生的化學(xué)成分變化。石榴皮渣、PCNC的FTIR光譜見圖2。圖中所有樣品都有2個(gè)主要的吸收峰集中區(qū)域,分別為2 700～3 500 cm-1與700～1 800 cm-1。3 400 cm-1附近區(qū)域的吸收峰歸因于纖維素結(jié)構(gòu)中羥基的伸縮振動[13]。2 900 cm-1附近的峰歸因于纖維素中β-糖苷環(huán)中碳?xì)滏I的拉伸。1 731 cm-1附近的吸收峰主要是半纖維素的乙酰基或木質(zhì)素中的芳香族基團(tuán)中碳氧雙鍵的拉伸[12],在PCNC中并未觀察到此吸收峰,表明半纖維素或木質(zhì)素的溶解或去除。1 620 cm-1附近的吸收峰來源于樣品中水的氫氧鍵,1 515 cm-1附近的吸收峰是木質(zhì)素中碳碳雙鍵的震動[14]。1 430 cm-1附近的吸收峰與結(jié)晶帶相關(guān),是—CH2對稱拉伸或醚鍵的拉伸[8,15]。1 350 cm-1和1 175 cm-1附近的吸收峰,表明PCNC中存在磺酸鹽[12],這可能是在用硫酸水解時(shí)引入的。1 250 cm-1附近的吸收峰對應(yīng)木質(zhì)素芳基中烷基醚的拉伸。1 160 cm-1附近的吸收峰歸因于吡喃糖環(huán)骨架醚鍵伸縮和碳碳單鍵的拉伸[9]。1 056 cm-1附近的吸收峰歸因于吡喃糖環(huán)的C—O—C鍵的拉伸。890 cm-1附近的吸收峰與典型纖維素的—CH搖擺振動(特定于β-葡萄糖苷)有關(guān)[16]。FITR光譜表明石榴皮渣經(jīng)處理后,半纖維素和木質(zhì)素被有效地去除了,這與熱穩(wěn)定性結(jié)果一致,與RASHID等[17]對稻殼納米纖維素的FTIR分析結(jié)果相似。

圖2 PCNC、石榴皮渣FITR光譜圖Fig.2 FITR spectra of pomegranate peel residue and PCNC

2.3 結(jié)晶度分析

纖維素主要由通過分子內(nèi)或分子間(氫鍵、范德華力)作用形成的結(jié)晶區(qū)和無定形區(qū)組成[15]。通過X射線衍射可分析石榴皮渣和PCNC的晶體結(jié)構(gòu)和結(jié)晶度指數(shù)。XRD衍射圖譜如圖3所示,PCNC衍射圖譜中觀察到3個(gè)結(jié)晶峰,分別為2θ= 15.4°(110)、22.4° (200)、 34.1°(004),這是纖維素I 的典型晶體結(jié)構(gòu)。石榴皮渣前2個(gè)峰較為明顯,在34°附近未觀察到結(jié)晶峰,且經(jīng)處理后的PCNC結(jié)晶峰強(qiáng)度顯著增加,表明半纖維素、木質(zhì)素和非結(jié)晶纖維素在處理過程中,被有效地去除掉了。這與DAHLEM等[18]對馬黛茶納米纖維素XRD圖譜所呈現(xiàn)的結(jié)果一致。纖維素的結(jié)晶度是影響纖維素在復(fù)合材料中的增強(qiáng)能力和機(jī)械強(qiáng)度的關(guān)鍵因素,高結(jié)晶度的纖維素能更有效地增強(qiáng)復(fù)合材料的性能[19]。通過公式(1)計(jì)算得出,石榴皮渣、PCNC的結(jié)晶度分別為33%、63%。這與LUZI等[20]提取的北非草納米纖維素結(jié)晶度為70%,FENG等[21]提取的甘蔗渣納米纖維素結(jié)晶度為73.6%,DAI等[16]提取的菠蘿皮納米纖維素結(jié)晶度為61%,結(jié)果接近。

圖3 PCNC、石榴皮渣XRD衍射圖Fig.3 XRD patterns of pomegranate peel residue and PCNC

2.4 熱穩(wěn)定性分析

通過DSC、TGA對石榴皮渣和PCNC進(jìn)行熱穩(wěn)定性分析,結(jié)果如圖4所示。DSC曲線圖(圖4-A)表示石榴皮渣和PCNC的熱流率(吸熱或放熱速率)隨溫度變化的函數(shù)關(guān)系,所有樣品均呈現(xiàn)吸熱現(xiàn)象,并且PCNC出現(xiàn)的吸熱峰所需溫度更低。這是因?yàn)殇J度與結(jié)晶區(qū)域的存在有關(guān),在提取過程中,非纖維素物質(zhì)被去除了,所以PCNC的吸熱峰更尖銳[17]。DSC研究證實(shí)了PCNC具有比原材料更高的結(jié)晶度,與XRD結(jié)果一致。TG曲線圖(圖4-B)表示石榴皮渣和PCNC的殘余重量隨溫度變化的函數(shù)關(guān)系。石榴皮渣和PCNC在30～80 ℃時(shí)出現(xiàn)較快的質(zhì)量損失,這是由于水分在此階段的溫度下快速蒸發(fā)所導(dǎo)致的,而石榴皮渣質(zhì)量損失更多,是因?yàn)槠浜枯^高。石榴皮渣、PCNC的主要質(zhì)量損失發(fā)生在200～400 ℃區(qū)間。原因是石榴皮中主要含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等物質(zhì)。纖維素具有較高的結(jié)晶度,這使其具有熱穩(wěn)定性,其降解溫度大概在 315～400 ℃。半纖維素和木質(zhì)素是無定形的,在纖維素之前開始降解,由于乙酰基的存在,半纖維素的熱穩(wěn)定性較差,其降解區(qū)間為220～315 ℃。木質(zhì)素含有大量的芳香環(huán),具有各種分支結(jié)構(gòu),可在較寬的溫度范圍內(nèi)降解,其降解區(qū)間為160～900 ℃。DTG曲線圖(圖4-C)表示石榴皮渣和PCNC的質(zhì)量損失速率隨溫度變化的函數(shù)關(guān)系。石榴皮渣在200～400 ℃出現(xiàn)了2個(gè)降解峰,第一個(gè)峰為半纖維素的降解峰(峰谷在240 ℃左右),第二個(gè)峰為纖維素的降解峰(峰谷在336 ℃左右),由于木質(zhì)素的降解溫度范圍較大,因此沒有呈現(xiàn)明顯的降解峰,而PCNC只呈現(xiàn)一個(gè)纖維素的降解峰(峰谷在321 ℃左右)。因此PCNC中纖維素的熱穩(wěn)定性比石榴皮渣纖維素的熱穩(wěn)性低,原因可能是由于在酸水解過程中,納米纖維素的分子質(zhì)量急劇下降和高度硫酸化的無定形區(qū)域降解所致,同時(shí)通過硫酸水解引入硫酸根基團(tuán)可顯著降低纖維素納米晶體降解的活化能[22]。并且在PCNC的DTG曲線中,纖維素降解速率出現(xiàn)驟降后驟升,這是由于高度硫酸化的無定形區(qū)域先行降解所導(dǎo)致的。溫度超過400 ℃后,石榴皮渣、PCNC降解速率變緩,在此階段主要是碳質(zhì)殘留物的降解及單體D-吡喃葡萄糖單元分解成殘基。在此溫度區(qū)間內(nèi),石榴皮渣降解速率一直高于納米纖維素,這是可能是由于石榴皮渣中木質(zhì)素仍在緩慢降解所導(dǎo)致的。這與DE等[23]對巴西白茅草納米纖維素的研究結(jié)果相似。

A-DSC;B-TG;C-DTG圖4 PCNC、石榴皮渣DSC、TG、DTG曲線圖Fig.4 DSC, TG, DTG curves of PCNC and pomegranate peel residue

2.5 微觀結(jié)構(gòu)分析

通過SEM圖像分析納米纖維素的形態(tài)是一種非常常見的方法,且纖維素的來源和制備方法對納米纖維素的尺寸和性質(zhì)有較大的影響。PCNC、石榴皮渣SEM圖如圖5所示。在圖5-B中,石榴皮渣的表面粗糙程度高于PCNC,這是因?yàn)槲唇?jīng)處理的石榴皮渣纖維素周圍存在膠結(jié)材料(如果膠、半纖維素和木質(zhì)素),從而導(dǎo)致表面不規(guī)則[16]。在圖5-A中觀察到其形態(tài)呈薄片狀,這是由于在處理過程中,PCNC表面的羥基之間會形成氫鍵造成的。然而SEM 圖并無法清楚地觀測PCNC的真實(shí)結(jié)構(gòu)。

A-PCNC;B-石榴皮渣圖5 PCNC、石榴皮渣SEM圖Fig.5 SEM images of PCNC and pomegranate peel residue

AFM可對納米纖維素的形態(tài)和結(jié)構(gòu)進(jìn)行檢測,PCNC、石榴皮渣AFM二維、三維圖如圖6所示。在圖6-A中,PCNC為200×50 nm左右的棒狀結(jié)構(gòu),硫酸的水解作用通常會橫向切割纖維的無定形區(qū)域,導(dǎo)致纖維直徑從微米減小到納米,從而具有納米尺寸,由于AFM 測量中存在尖端展寬效應(yīng),所以納米纖維素顆粒的計(jì)算寬度大于實(shí)際值[9]。在圖6-B中,石榴皮渣為直徑500 nm左右的圓形結(jié)構(gòu),由于是使用高度稀釋的懸浮液進(jìn)行檢測的,因此所顯示的石榴皮渣尺寸相對實(shí)際較小。在AFM圖中存在明暗2種不同的區(qū)域,其中明亮區(qū)域代表結(jié)晶區(qū)域,而黑暗區(qū)域代表纖維素結(jié)構(gòu)中纖維軸方向的無定形部分[5]。在圖6-C和圖6-D中可以觀察到PCNC的明亮峰形區(qū)域多于石榴皮渣,表明PCNC的結(jié)晶度大于石榴皮渣,這與XRD所呈現(xiàn)的結(jié)果一致。與HUSSIN等[24]從毛棕櫚葉中提取納米纖維素的AFM圖像一致。

3 結(jié)論

采用酸水解法成功從石榴皮中提取了PCNC。在形態(tài)上,PCNC具有納米尺寸,呈棒狀結(jié)構(gòu),并且其懸浮液具有良好的穩(wěn)定性,不易聚沉。石榴皮渣經(jīng)過酸處理后,無木質(zhì)素和半纖維素殘留,具有較高的純度,同時(shí)還具有較高的結(jié)晶度,結(jié)晶度為63%,但是經(jīng)處理后的PCNC,熱穩(wěn)定性稍有降低。石榴皮可作為納米纖維素新的來源,能以纖維素納米晶體的形式增加其應(yīng)用潛力,用于制備多種生物納米復(fù)合材料,應(yīng)用于食品加工、貯藏、包裝等眾多領(lǐng)域。