檸檬苦素誘導塔賓曲霉UA13高產檸檬苦素轉化酶的研究

陳鈺亭,李文杰,楊睿昕,雷生姣*,王順順,楊丹丹,歐陽儂非

1(三峽大學 生物與制藥學院,湖北 宜昌,443002)2(河南工業大學 國際教育學院,河南 鄭州,450000)

柑橘類水果兼具營養價值與藥用價值,富含人體生長發育必須的維生素、膳食纖維、以及類黃酮類等生物活性物質[1],具有抗氧化[2]、抗癌[3]、肝臟保護[4]、延緩衰老[5]和預防各種慢性疾病等功效[6],深受消費者的喜愛。相較于國外柑橘深加工業,我國的發展仍處于初級階段,柑橘加工業滯后于種植業,具有非常大的增長空間。檸檬苦素類化合物(limonoids)的典型代表物——檸檬苦素(limonin),是柑橘類水果出現苦味和“后苦味”的主要物質[7],極大地影響了柑橘汁的口感,而“后苦味”則嚴重制約了柑橘加工業的發展,亟待解決。檸檬苦素[8]又稱檸堿,是一種三萜化合物,在水溶液中的苦味閾值為1.0 mg/L,在果汁中的苦味閾值為3.4 mg/L,約為柚皮苷的20倍[9]。檸檬苦素在鮮果或鮮榨果汁中含量較低,多以無苦味的檸檬苦素A-環內酯存在于細胞質內,但長時間放置或熱處理等會使其苦味加劇[10]。如圖1所示,這種“后苦味”現象是由于在酸性條件(pH<6.5)下,檸檬苦素A-環內酯在檸檬苦素D-環內酯水解酶催化下轉化為有苦味的檸檬苦素[11]。果肉組織在冰凍[12]、機械損傷[13]或熱處理[14]等條件下,其酸度均會增強,進而促進了加工或貯藏過程中檸檬苦素的生成[15]。

圖1 檸檬苦素A環內酯催化為檸檬苦素的示意圖Fig.1 Schematic diagram of the catalysis of limonin A-cyclic lactone to limonin

前期研究顯示,本實驗室選育的ARTP誘變菌株塔賓曲霉UA13[16]能同時水解柚皮苷和檸檬苦素,但對檸檬苦素的水解能力較弱。因此,本研究在前期試驗的基礎上,以檸檬苦素為誘導物對該菌株進行產酶誘導,以期提高其產檸檬苦素轉化酶的能力。在搖瓶發酵基礎上進行1 L發酵罐優化實驗,確定最佳發酵產酶條件,并對所得到的酶進行性質研究,為建立可同時水解兩種柑橘苦味物質的酶制劑技術奠定理論基礎,并為微生物發酵技術提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

實驗室菌株塔賓曲霉(Aspergillustabin)UA13,保藏編號M 2022989,本實驗室初次分離誘變保藏。

1.1.2 培養基

固體培養基[16](g/L):MgSO4·7H2O 1.0,KH2PO41.0,(NH4)2SO41.5,KCl 0.5,KNO31.5,CaCl20.1,酵母提取物 2.0,檸檬苦素1.0 mg/L,瓊脂粉 10.0,自然pH。

種子培養基(g/L):檸檬苦素4.0 mg/L,MgSO4·7H2O 5.0,K2HPO45.0,KCl 5.0,FeSO4·5H2O 0.1,瓊脂粉10.0,自然pH,接種量10%(體積分數)。

發酵培養基(g/L):MgSO4·7H2O 0.5,KH2PO41.5,K2HPO41.5,(NH4)2SO44.0,ZnSO4·7H2O 0.1,CaCl20.1,酵母提取物 1.0,豆粉 2.0,蛋白胨 2.0,檸檬苦素4.0 mg/L,自然pH,接種量10%(體積分數)。

1.1.3 試劑

檸檬苦素(標準品≥98%)、對-二氨基苯甲醇(分析純),上海阿拉丁生化科技股份有限公司;柚皮苷(分析純),上海源葉生物科技有限公司;CH3COOH、CH3COONa、一縮二乙二醇(diethylene glycol,DEG)、95%乙醇、無水乙醇、NaOH、H2SO4、FeCl3(均為分析純),國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

ME204E電子天平,梅特勒-托厲多儀器(上海)有限公司;ZW0615062604紫外可見光分光光度儀,上海光譜儀器有限公司;HENCZI紅外快速干燥箱,上海躍進醫療器械有限公司;SX700高壓蒸汽滅菌鍋,日本TOMY公司;SW-CJ-2FD超凈工作臺、SPX-605-II生化恒溫培養箱,上海新苗醫療器械制造有限公司;IS09001恒溫搖床,世平實驗設備有限公司;FUG-1L×4-P發酵罐,上海國強生化工程裝備有限公司;LG10-2.4A離心機,上海安亭科學儀器廠;HH-2恒溫水浴鍋,常州國華電器有限公司;XSP-7CZ生物顯微鏡,上海長方光學儀器有限公司;渦旋振蕩儀,上海舜宇恒平科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發酵培養

孢子懸浮液:將實驗室貯藏的斜面菌株塔賓曲霉UA13接種于平板培養基上,30 ℃培養3～4 d至孢子成熟。用0.85%的無菌生理鹽水洗下孢子并打散,得到菌懸液。對孢子懸液進行鏡檢計數,將濃度調整為107個/mL左右即可。

種子液:將調整好濃度的孢子懸浮液按10%(體積分數)的接種量接入種子培養基中,于30 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養。

菌種發酵:將調整好的孢子懸浮液用無菌槍頭吸取5 mL(接種量10%,體積分數)接入已滅菌的裝液量50 mL/250 mL的發酵培養基中(5顆玻璃珠)。于30 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養72 h。

1.3.2 酶活力測定

a)粗酶液的制備:取搖瓶發酵培養72 h的發酵液于離心管中,5 000 r/min離心20 min。

b)檸檬苦素含量的測定:參照王菁等[17]方法并進行改進,分別取0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8 mL的200 μg/mL的檸檬苦素標準溶液置于25 mL具塞試管中,無水乙醇補足至2 mL,再各加入5 mL顯色液,充分搖勻后靜置顯色30 min,在500 nm下測定吸光度。以檸檬苦素含量為橫坐標,吸光度為縱坐標得標準曲線方程,為A=0.003 8C+0.037 9,R2=0.999 7。

顯色液的配制(現配現用):精確稱取125 mg的對二氨基苯甲醛溶解于100 mL的硫酸-無水乙醇混合液,V(對二氨基苯甲醛)：V(硫酸-無水乙醇)=65：35(冷卻后使用),再加入0.5 mL,體積分數0.9%的FeCl3,混勻即可。

c)檸檬苦素轉化酶活力測定:參照田慶國等[18]方法并進行適當改進,于具塞試管中加0.5 mL、200 μg/mL底物檸檬苦素,再加入0.1 mL一定濃度的酶液,用無水乙醇補足到2 mL。將其置于60 ℃的恒溫振蕩器(150 r/min)中酶解30 min,取出酶解液立即置于100 ℃的沸水浴中滅活5 min;于酶解液中添加5 mL的顯色液,混勻后靜置顯色30 min。取出注入1 cm比色皿內,用分光光度計在500 nm處測定吸光值。

所有樣品平行測定3次,取平均值進行分析(下同)。

酶活力定義:在60 ℃,pH 4.0的條件下,1 min消耗1 μg檸檬苦素所需的酶量定義為1個酶活力單位(U)。計算如公式(1)所示:

(1)

相對酶活力定義:同組實驗中最高酶活定義為100%,其他條件下酶活力值與最高值之比×100定義為相對酶活力(%)。

1.4 產酶條件優化

1.4.1 搖瓶發酵優化

以檸檬苦素轉化酶活力為評價指標,采用單因素試驗探究菌株的最佳產酶條件。在初始培養條件下,接種一定種齡的種子液,改變發酵培養基的接種量(4%～16%,體積分數)、發酵溫度(25～40 ℃)、發酵液初始pH值(4.0～9.0),確定菌株最佳的發酵環境。

1.4.2 1 L發酵罐優化試驗

1 L發酵罐四聯罐同步連續發酵,將種子液同步培養后接種至600 mL的已滅菌發酵液中(接種量10%,體積分數)。在通氣量0.4 L/min,攪拌轉速300 r/min,初始pH值為5.0的初始條件下進行放大培養。在搖瓶優化結果的基礎上,分別對攪拌轉速(200～350 r/min)、發酵溫度(25～40 ℃)、發酵初始pH值(4.0～7.0)進行優化,通過對發酵過程中菌株生長與產酶情況確定最適產酶條件。

酶活力提高倍數的分析以搖瓶發酵優化后的酶活力為基礎進行比較研究。

1.5 酶的底物親和性和酶的最適反應條件研究

酶最適反應條件:發酵液離心后的上清液即為粗酶液。探究粗酶液在不同酶解溫度(30～70 ℃)和pH值(2.0～8.0)對酶活力的影響及其對酶穩定性的影響。以同組實驗中測定最高酶活力為100%,計算其他條件下的相對酶活力。

酶的底物親和性:測定酶催化3種底物(檸檬苦素、柚皮苷、橙皮苷)的米氏常數Km值,探究酶對底物的親和性,采用雙倒數法(Linewear-Burk)求得Km。

2 結果與分析

2.1 產酶條件優化

2.1.1 菌株接種量對產酶的影響

種子液的濃度以及菌種的生理狀態會直接影響發酵效果[19]。種子培養基培養的時間一定程度上決定了種子活力的強弱,特別是絲狀真菌,其菌體的形態和養分傳質都會受到影響。在前期研究的基礎上,以不同接種量接種48 h的種子培養基到搖瓶中發酵培養,菌株產酶活力如表1所示。

表1 不同接種量對菌株UA13產酶的影響Table 1 Effects of different inoculum amounts on enzyme production by strain UA13

接種量的多少對發酵周期有直接的影響,接種量過低,菌株密度小,生長周期延長;接種量過高,營養物質和氧氣供應不足,菌體營養不良,產酶能力也會下降[20]。由表1可知,接種量對菌株發酵產酶的活力影響較小。接種量在4%～10%(體積分數)范圍內時,菌株產酶能力均維持在相對較高的水平,活力最高達6.68 U/mL。綜合考慮產酶活力與發酵時間,本研究確定接種量10%(體積分數)作為后續研究的基礎(下同)。

2.1.2 菌株發酵溫度對產酶的影響

改變發酵溫度,探究菌株產檸檬苦素轉化酶的最適培養溫度,結果如表2所示。

表2 發酵溫度對菌株UA13產酶的影響Table 2 Effects of different fermentation temperature on enzyme production by strain UA13

不同微生物適宜的培養溫度不同,溫度會影響菌株的代謝及生長狀態,從而影響產酶能力[21]。由表2 可知,菌株在25～40 ℃發酵培養時,菌株產酶活力隨培養溫度的增加呈現先增加后下降的趨勢,酶活在35 ℃時達到最大(10.09 U/mL)。因此,本研究采用發酵溫度35 ℃進行后續實驗。

2.1.3 初始pH值對產酶的影響

培養基的初始pH值會對酶的結構和功能、細胞的結構、細胞膜的電荷狀況等造成影響[22]。微生物在生長過程中產生的代謝產物也會造成培養基的pH值發生變化。不同菌株生長代謝及產酶的適宜pH值范圍不同。由表3可知,發酵初始pH值為5.0～6.0時,菌株發酵產酶能力較強,初始pH 5.0時,酶活力最高可達11.60 U/mL。因此,本研究采用初始pH 5.0進行后續實驗。

表3 發酵初始pH值對菌株UA13產酶的影響Table 3 Effects of different fermentation initial pH on enzyme production by strain UA13

在單因素試驗基礎上,以9.0 mg/L的檸檬苦素為碳源兼誘導物,接種10%(體積分數)發酵48 h的種子培養基,在初始培養基pH 5.0,發酵溫度35 ℃條件下發酵72 h,菌株UA13產檸檬苦素轉化酶的最高酶活力可達11.60 U/mL。

2.2 發酵罐優化實驗

為了提高微生物發酵水平,在搖瓶實驗的基礎上,開展實驗室小型發酵罐優化實驗。發酵過程中溶氧的變化能夠反映菌株生長狀態[23]。如圖2所示,發酵開始24 h菌體處于遲滯期,溶氧急劇下降,培養基中的氧氣被充分利用。隨后,溶氧開始逐漸上升,酶的生物合成開始,菌體進入生長指數期,酶活力開始持續增加,發酵72 h酶活力達到最高,為25.48 U/mL,與優化后搖瓶發酵的最高酶活力(11.60 U/mL)相比提高了119.7%。培養基的pH值是動態變化的,其值從發酵開始迅速下降,隨后逐漸上升,最后在4.3～4.8波動。

圖2 未優化發酵條件下菌株UA13于1 L發酵罐中的發酵曲線Fig.2 Fermentation curve of strain UA13 in 1 L fermenter under unoptimized fermentation conditions

2.2.1 攪拌轉速對產酶的影響

在搖瓶培養時通過搖床轉動以及添加適量的玻璃珠來促進各物質的融合,避免菌絲體結團而影響發酵產酶。從搖瓶放大至發酵罐中,攪拌參數的控制很大程度上決定著罐體內物質混合和發酵產酶的效率。若攪拌速度過快,過大的剪切力會影響細胞的生成和組成,對菌體發酵產酶造成不利影響[24];若攪拌轉速過低,菌絲體纏繞成團,不利于發酵生產。

如圖3所示,攪拌轉速為200 r/min時,由于攪拌轉速較低,菌絲體生長較慢,遲滯期較長,36 h進入生長對數期。菌體產酶能力在48 h時達到最大,為34.04 U/mL,隨后持續下降。而搖瓶實驗可知菌株通常在72 h時產酶活力達到最高,造成差異的原因可能是發酵罐的轉速過低,菌絲體在后續未繼續斷裂繁殖,而是大量纏繞成球在罐內擋板上影響產酶;攪拌轉速為350 r/min時,發酵罐中的溶氧增加,但過高的剪切力會加速菌絲體的衰亡,發酵60 h時酶活力達到最高(33.78 U/mL);轉速為250、300 r/min時的發酵變化趨勢相差不大:菌株在250 r/min轉速下,于48 h時酶活力達到最高(42.61 U/mL),提高了267.3%。菌株在300 r/min轉速下,于60 h時酶活達到最高(43.23 U/mL),提高了272.7%。考慮到實際發酵中節省能源,且兩種轉速下的酶活力相差不大,選擇250 r/min為最優轉速更為適宜。

a-酶活;b-溶氧圖3 攪拌轉速對菌株UA13產酶的影響Fig.3 Effects of different stirring speeds on enzyme production by strain UA13

2.2.2 發酵溫度對產酶的影響

發酵溫度會通過影響發酵液的性質和溶氧而對酶的生物合成造成影響,適宜的發酵溫度有利于微生物的生長和產物的積累[25]。

如圖4所示,不同溫度下的菌株發酵曲線趨勢基本一致:當發酵溫度控制在25 ℃和40 ℃時,酶活力均在48 h達到最高,分別為28.80 U/mL和30.46 U/mL,酶活力相對較低,與搖瓶發酵情況一致;在30、35 ℃時,菌株產酶活力在36 h分別達到40.10、35.61 U/mL,在發酵60 h時兩者均出現二次生長。綜上所述,菌株在30～35 ℃均有良好的產酶能力,在30 ℃的培養溫度下,菌株提前在36 h酶活力就達到最高40.10 U/mL,相較于優化前提高了245.7%,縮短了發酵周期。因此,選擇培養溫度30 ℃進行后續發酵罐優化實驗。

a-酶活;b-溶氧圖4 發酵溫度對菌株UA13產酶的影響Fig.4 Effects of different fermentation temperatures on enzyme production by strain UA13

2.2.3 發酵液初始pH值對產酶的影響

如圖5所示,在初始pH 5.0條件下,發酵前12 h,溶氧迅速下降。在12～48 h,發酵罐的溶氧趨近于零,基本維持10%以下,說明初始pH 5.0條件下菌株代謝旺盛,更適宜生長,與搖瓶實驗結果一致。在48 h時,檸檬苦素轉化酶活力已達到48.52 U/mL,相較于優化前提高了318.3%;在發酵初始pH 6.0條件下,菌株在48～72 h都維持著較好的產酶能力,酶活最高可達40.16 U/mL,提高了246.2%;發酵液初始pH 4.0時,酶在96 h時達到最高活力,為38.82 U/mL,提高了234.7%。綜上所述,發酵液的最適初始pH值為5.0,且塔賓曲霉UA13在初始pH 4.0～6.0的生長和產酶能力較強,此菌株更適宜在偏酸環境中生存,與搖瓶實驗結果一致。

a-酶活力;b-溶氧圖5 發酵液初始pH值對菌株UA13產酶的影響Fig.5 Effects of different fermentation initial pH on enzyme production by strain UA13

2.3 檸檬苦素轉化酶性質研究

2.3.1 檸檬苦素轉化酶最適酶解溫度的研究

溫度是影響底物轉化效率的重要因素。溫度過低時,許多酶分子未被激活,酶解效果極低。溫度過高超過酶熱穩定性范圍時,酶蛋白失活[26]。適宜的酶解溫度可以使底物的轉化效率達到最大。

由表4可知,酶解溫度在30～70 ℃時,檸檬苦素轉化酶的活力隨溫度升高呈先增加后下降的趨勢,在60 ℃時酶活力達到最高,為16.50 U/mL;當酶解溫度為70 ℃時,檸檬苦素轉化酶活力仍有59.5%。同時,對轉化酶的粗提物在不同溫度下的穩定性進行研究,確定了此酶活力在4 ℃條件下保存240 min,其活力下降了55.1%,在20 ℃條件下保存240 min,其活力僅下降了39.5%。因此,本研究的檸檬苦素轉化酶具有良好的耐熱性,且采用酶解溫度60 ℃進行后續實驗。何玉蘭等[27]對黑曲霉重組酸性果膠裂解酶進行研究,該酶在30～50 ℃能保持80%以上的相對酶活,最適反應溫度為50 ℃。

表4 酶解溫度對檸檬苦素轉化酶活力的影響Table 4 Effects of different enzymolysis temperatures on the activity of limonin debitrase

2.3.2 檸檬苦素轉化酶最適酶解pH值的研究

一般情況下,真菌產柚苷酶的最適pH值在3.0～6.0[28]。不適宜的pH值會對酶蛋白的構象造成影響,從而使酶活降低。

由表5可知,菌株UA13在酶解pH 2.0～8.0的酶解環境下,酶活力呈現先增加后下降的趨勢。在酶解pH 5.0時,酶活力最高可達21.33 U/mL;pH 3.0時相對酶活力有90.6%;pH 7.0時相對酶活力有81.1%。且實驗可知此酶在pH 3.0～5.0穩定性良好,在pH 3.0環境下仍能保留61.2%的活力。因此,此酶具有良好的耐酸性,能較好地適用于柑橘果汁加工業。彭程等[29]研究了黑曲霉α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的特性,該酶在pH 3.0～8.0具有良好的活力,且最適酶解pH值也為5.0。

表5 不同酶解pH值對檸檬苦素轉化酶活力的影響Table 5 Effects of different enzymolysis temperatures on the activity of limonin debitrase

2.4 底物親和性研究

測定本實驗室的檸檬苦素轉化酶粗酶液在不同底物濃度下的反應速率,利用Linewear-Burk曲線得出相應的動力學參數。本研究發現經檸檬苦素誘導后的菌株發酵產酶催化3種不同底物(檸檬苦素、橙皮苷、柚皮苷)的反應皆符合米氏動力學規律(圖6)。

圖6 檸檬苦素轉化酶催化不同底物的Linewear-Burk曲線Fig.6 Linewear-Burk curves of different substrates catalyzed by limonin debitrase

實驗可知,底物為檸檬苦素時,Km=0.622 mmol/L,Vmax=0.017 mmol/(L·min);底物為橙皮苷時,Km=0.967 mmol/L,Vmax=0.010 mmol/(L·min);底物為柚皮苷時,Km=0.999 mmol/L,Vmax=0.018 mmol/(L·min)。此粗酶液具有水解檸檬苦素、橙皮苷、柚皮苷的能力,且水解的動態規律符合酶促反應動力學。由Km值可知此粗酶液對底物親和性大小為檸檬苦素>橙皮苷>柚皮苷。因此,此酶對檸檬苦素的親和性優于柚皮苷,這可能是由于檸檬苦素在菌株生長中作為誘導物兼碳源導致的結果。

大多數脫苦酶對柚皮苷有著更高的底物親和性[30-31]。本實驗室前期研究以柚皮苷為誘導物對菌株進行發酵培養,探究酶對底物親和性的大小,發現柚皮苷誘導后的酶對柚皮苷親和性更高(Km=0.480 mmol/L),對檸檬苦素的底物親和性較差(Km=91.920 mmol/L)。因此,可以推斷誘導物的不同對菌株生長產酶有著很大的影響,經長期誘導和優化后的菌株對相應的誘導物的底物親和性會更好,酶解相應的苦味物質能力更強。

3 結論

本研究采用單因素試驗,確定菌株UA13發酵產檸檬苦素轉化酶的最適種齡、接種量、發酵溫度以及發酵液的初始pH值。在此基礎上,對菌株進行了1 L 發酵罐優化試驗,確定菌株更適宜在250 r/min、30 ℃、pH 5.0環境下生長,酶活力最高可達48.52 U/mL,相較于優化前提高318.3%,且縮短了發酵周期,為檸檬苦素轉化酶的工業化量產奠定了基礎。

通過對檸檬苦素轉化酶的性質和底物親和性進行研究,結果表明此酶可同時酶解柑橘加工中的兩種苦味物質(檸檬苦素、柚皮苷),對兩者的底物親和性都較好,這是目前大多數轉化酶所不具備的。同時檸檬苦素轉化酶具有較好的耐熱性和耐酸性,能夠更好的適用于柑橘加工業,具有較好的商業價值。