復配精油抑菌劑的制備及其對鮮切豬肉的抑菌作用

李娜,喬宏萍,王宇欣,安金花,杜曉雅,李曉君

1(太原師范學院 生物科學與技術學院,山西 晉中,030619)2(中北大學 化學與化工學院,山西 太原,030000)

植物精油[1]是從芳香植物中的器官通過壓榨、蒸餾等方法制備而得,最常用的方法為水蒸氣蒸餾法[2],該方法適用于水溶性較差精油的提取。植物精油用途廣泛,常因為其沁人心脾的香味及廣泛的抑菌性而用于化妝品中,桂宇豪等[3]對6種精油的研究表明,精油具有溫和性與適當的保鮮作用,從而使化妝品中防腐劑用量及刺激性均有所降低。天然植物中提取出來的有效殺菌成分,其所具有的優點是其他殺菌劑所無法比擬的,即容易分解、毒性較低、安全環保[4]、抗藥性產生率低[5]等,其相比于毒性較強、殘留量較高的化學合成殺菌劑[6],天然的植物精油更受歡迎,更安全且環保性能更高[7],并且具有能讓水果保鮮的特性[8],契合當今人們的需求,具備良好的應用前景和發展優勢,是一種極有潛力的生物資源[9]。

肉桂屬于樟科植物,其主要成分肉桂醛具有良好的抑菌作用[10];紫蘇是唇形科植物,在我國資源豐富,苑佳佳[11]研究表明不同品種的紫蘇葉精油對于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌及金黃色葡萄球菌均具有抑菌作用;牛至常作為調味品使用,由于酚類及萜烯類的存在使其具有較強的抗菌性[12]。消毒劑是指具有消毒作用的藥物,主要作用于細胞壁、細胞膜及核酸[13]。復配精油可緩解單一植物精油的弊端,推動新型消毒劑的研發,進一步優化配比,實現可持續發展[14]。王帆等[15]研究表明,不同精油間的復配有抑菌增效的作用,在保證抑菌作用的前提下可有效降低所需生產成本。

各種肉及肉制品是人類獲取蛋白質、維生素等營養成分的重要來源,肉制品品質的好壞直接關系到人類健康,隨著人們生活水平的提高,人們對肉制品的質量要求也愈來愈高。肉制品品質的評定指標主要包括感官特征、營養價值、理化性質等,因此,通過測定肉制品水分含量、pH值、蛋白質含量、感官指標以及菌落總數等可以更好地反應肉制品的好壞程度。目前,對鮮切豬肉防腐保鮮的主要方法是使用化學合成防腐保鮮劑,雖然化學合成防腐保鮮劑的防腐保鮮效果較好,但很多市售化學合成保鮮劑通常含有對人體健康存在潛在危害的化學合成類物質,不利于保障食品安全與人類健康。因此,本試驗通過研究肉桂精油、紫蘇精油和牛至精油復配時的抑菌作用,制備一種以植物精油為主要成分的天然防腐保鮮劑,并對鮮切豬肉的抑菌作用進行研究,以期為新型植物精油抑菌保鮮劑的制備提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油均由水蒸氣蒸餾法提取所得;新鮮豬肉若干,山西省太原市連鎖超市;其他試劑均為分析純試劑,上海麥克林生化科技有限公司。大腸桿菌(Escherichiacoli)CGMCC 44568、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)CGMCC 26085,中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 Tween-80濃度確定

植物精油消毒劑制備過程中“油水互溶”是關鍵技術之一,Tween-80作為一種增溶劑[16],極易吸附到油水界面處[17],從而增加精油在水中的溶解性,進一步促進油水體系的均一性與穩定性,因而,本實驗采用Tween-80為增溶劑,設置添加量梯度為5、10、15、20 μL/mL,固定精油含量為10 μL/mL,利用超聲波振蕩儀振蕩2～3 min,使其充分混合均勻。通過觀察油水體系的透明度來判斷Tween-80的最佳濃度。

1.2.2 三種精油的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)

取無菌96孔板,以無菌水作對照,采用微量二倍稀釋法[18],獲得精油質量濃度為0～20 mg/L的菌懸液,37 ℃培養24 h。同一菌種同一精油操作重復3次。在小孔內或試管內可完全抑制細菌生長的最低藥物濃度即為MIC[17]。

1.2.3 復配精油分級抑菌濃度(graded bacteriostatic concentration,FIC)指數

根據單一植物精油MIC,采用棋盤稀釋法[18],將肉桂精油、紫蘇精油及牛至精油進行兩兩復配。取無菌96孔板,在1～6列依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC一種精油50 μL,在A～F行依次加入2、1、1/2、1/4、1/8、1/16 MIC的另一種精油50 μL,最后加入菌液50 μL,37 ℃培養24 h。每一種復配重復做3次。FIC指數[19]是對兩種抗菌藥的聯合藥敏情況的描述,包括協同、相加、無關和拮抗4種情況,其計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A0為A組分聯合使用時的MIC值;A為A組分單獨使用時的MIC值;B0為B組分聯合使用時的MIC值;B為B組分單獨使用時的MIC值。當FIC≤0.5時為協同作用,當0.052時為拮抗作用[20]。

1.2.4 復配精油抑菌保鮮劑對鮮切豬肉的保鮮作用

將新鮮豬肉平均分成空白對照組(CK:直接放入密封性良好的保鮮)和實驗組(放入密封性良好的保鮮盒后,將最優比例復配精油抑菌保鮮劑浸泡過的活性炭置于培養皿中,并放入保鮮盒),每天取樣測定鮮切豬肉的生化指標。參考GB/T 5009.3—2016《食品中水分的測定》,采用直接干燥法測定水分含量;參考GB/T 5009.237—2016《食品pH值的測定》測定豬肉pH值;采用高鹽法提取蛋白質[20],考馬斯亮藍法測定豬肉中蛋白質含量[16];參考GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗菌落總數測定》及平板計數法測定豬肉中微生物總量;用色差儀對豬肉糜的L*值、c*值、h*值進行測定并記錄,每個試樣取3個點進行測量。

1.3 數據處理與統計分析

實驗數據均為3次重復試驗結果的平均值,采用Origin 2019軟件進行作圖,采用SPSS 17.0軟件進行差異性分析,P<0.05表示具有顯著的統計學差異,P<0.01表示具有極顯著統計學差異。

2 結果與分析

2.1 Tween-80濃度

通過比對,當Tween-80含量為15 μL/mL時,總體系開始清澈透明,且靜置一段時間后仍呈現為透明均一的單相液體,因此,本次實驗操作所用Tween-80含量為15 μL/mL。

2.2 三種精油對兩種供試菌的MIC

通過微量二倍稀釋法測定3種精油對兩種供試菌的MIC,結果如圖1所示,肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油對于E.coli和S.aureus均具有抑菌作用,3種精油對E.coli和S.aureus的抑菌效果均表現為肉桂精油>紫蘇精油>牛至精油。

圖1 植物精油的MICFig.1 MIC of essential oils

2.3 復配精油FIC指數

2.3.1 肉桂精油-紫蘇精油的聯合抗菌效果

表1為肉桂精油與紫蘇精油復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1時,肉桂精油與紫蘇精油的聯合作用對E.coli的MIC為1/2 MICCEO～1/8 MICPEO,對S.aureus的MIC為1/2 MICCEO～1/4 MICPEO。其FIC值如表2所示,結合FIC指數的判定標準可知,肉桂-紫蘇精油復配物對E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2種精油的聯合作用比單一作用均表現為相加作用,復配精油的MIC值較一種精油單獨使用時的MIC值都有顯著的降低,復配精油對E.coli的MIC值為2種精油單獨使用的1/2和1/8倍;對S.aureus的MIC值為2種精油單獨使用的1/2和1/4倍。

表1 肉桂-紫蘇精油復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果Table 1 Antibacterial effect of cinnamon-perilla essential oil complex on E.coli and S.aureus

表2 肉桂-紫蘇精油復配FIC指數Table 2 FIC index of cinnamon-perilla essential oil complex

2.3.2 肉桂精油與牛至精油的聯合抗菌效果

表3為肉桂精油與牛至精油復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1的前提下,肉桂精油與牛至精油的聯合作用對E.coil的MIC為1/8 MICCEO～1/2 MICOEO,對S.aureus的MIC為1/4 MICCEO～1/4 MICOEO。其FIC值如表4所示,肉桂精油與牛至精油復配后對于E.coli的FIC值>0.5且≤1,2種精油的聯合作用效果表現為相加作用,對E.coli的抑制作用顯著增強,其MIC值為2種精油單獨使用的1/8和1/2倍;肉桂精油與牛至精油復配后對于S.aureus的FIC值為0.5,2種精油的聯合作用比單一作用表現為協同作用,其MIC值為兩種精油單獨使用的1/4倍。

表3 肉桂-牛至精油的復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果Table 3 Antibacterial effect of cinnamon-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus

表4 肉桂-牛至精油復配FIC指數Table 4 FIC index of cinnamon-oregano essential oil complex

2.3.3 紫蘇精油與牛至精油的聯合抗菌效果

表5為紫蘇精油與牛至精油復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果。在體積比為1：1的前提下,紫蘇精油與牛至精油的聯合作用對E.coli的MIC為1/2 MICPEO～1/2 MICOEO,對S.aureus的MIC為1/8 MICPEO～1/2 MICOEO。其FIC值如表6所示,紫蘇-牛至精油復配物對于E.coli和S.aureus的FIC值均>0.5且≤1,2種精油的聯合抑菌作用均表現為相加作用,聯合抑菌作用顯著高于單一精油的單獨抑菌作用。

表5 紫蘇-牛至精油的復配物對E.coli和S.aureus的抑制效果Table 5 Antibacterial effect of perilla-oregano essential oil complex on E.coli and S.aureus

表6 紫蘇-牛至精油復配FIC指數Table 6 FIC index of perilla-oregano essential oil complex

2.3.4 復配精油FIC值對應濃度的抑菌效果

LB固體培養基表面對照組菌落致密,甚至多數呈菌苔狀;實驗組中菌落稀疏,其菌落數如圖2所示,3種復配組合中肉桂-紫蘇精油復配物的抑菌效果顯著優于其他2種復配精油。

圖2 復配精油的菌落數Fig.2 Colony number of essential oils complex注:**表示P<0.01。

2.4 肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑對鮮切豬肉的保鮮效果

2.4.1 復配抑菌保鮮劑處理對鮮切豬肉水分含量的影響

鮮切豬肉中占比最大的是水分,鮮切豬肉在貯藏期間,由于外界環境的變化等因素,鮮肉中的水分會發生蒸騰作用,導致水分迅速流失,表面松弛,彈性喪失,質地下降。由圖3可知,隨著貯藏時間的延長,鮮豬肉的含水量不斷下降,呈現出持續的失重現象。但在貯藏1～4 d,空白對照組含水量從23%下降到5%,而實驗組含水量從23%上升到18%,實驗組水分含量在貯藏期間顯著高于對照組。因此肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑處理可以一定程度的防止鮮切豬肉水分過快的損失,從而延緩豬肉的萎縮與品質的下降。

圖3 復配抑菌保鮮劑處理對鮮切豬肉水分含量的影響Fig.3 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on water content of freshly cut pork in storage

2.4.2 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉pH值的影響

由圖4可知,隨著貯藏時間的延長,鮮切豬肉pH值呈現逐漸增大的趨勢,且空白對照組pH值增幅較實驗組大。在貯藏1 d后,空白對照組豬肉pH值已經超過7.00,而實驗組對pH值的平衡作用在1～3 d較為顯著,且實驗組pH值始終低于空白組。這可能是由于蛋白質的降解所致,蛋白質是一種高分子的兩性化合物,是影響肌肉pH的重要因素,隨貯藏時間的延長,在微生物及其分泌的酶的作用下,肌肉蛋白被降解為多肽和氨基酸,并釋放堿性基團,從而使肉的pH值逐漸升高,同時加熱處理對pH值也有影響[21-22]。

圖4 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉pH的影響Fig.4 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on pH of freshly cut pork in storage

2.4.3 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉蛋白質含量的影響

豬肉中除水分以外的主要組分是蛋白質和脂質,肌肉中蛋白質大致分為四類,其中,肌原纖維蛋白也稱為鹽溶性蛋白,約占總蛋白含量的50%[23],在鮮肉貯藏過程中,微生物會對其蛋白質進行分解,導致蛋白質含量下降。由圖5可知,雖然蛋白質含量都在下降,但空白對照組蛋白質含量都在實驗組之下,證明肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑可有效抑制蛋白質的分解。

圖5 復配精油抑菌劑處理對貯藏中蛋白質含量的影響Fig.5 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on protein content of freshly cut pork in storage

2.4.4 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉微生物數的影響

肉類食品中腐敗微生物的來源十分廣泛,污染的主要微生物有腸桿菌屬、莫拉氏菌屬、假單胞菌、氣單胞菌等[24]。菌落總數是評價食品安全時的重要指標,可以用來預測食品的保質期,同時可以作為食品細菌污染指標,是判定肉類被污染指數的主要依據之一[25]。由圖6可知,空白對照組豬肉在貯藏5 d后,其細菌數已超過5.0×106CFU/g,成為變質肉,而實驗組第8天仍未變質,且空白對照組菌落增長速度比實驗組快,證明肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑對細菌有抑制作用。

圖6 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉微生物菌數的影響Fig.6 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on number of bacterial of freshly cut pork in storage

2.4.5 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中鮮切豬肉色澤的影響

肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑處理對豬肉L*(亮度)、C*(色度值)、H*(色調值)的影響如圖7所示。隨著貯藏時間的延長,實驗組與空白對照組牛肉亮度與色度均呈現降低的趨勢,但實驗組牛肉亮度顯著高于空白對照組,說明肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑處理可有效保持牛肉的亮度;隨著貯藏時間的延長,豬肉色調值變化呈現逐漸增大的趨勢,且空白對照組均高于實驗組。色澤是消費者購買肉類時最直觀的指標,決定牛肉顏色的主要是肌紅蛋白和血紅蛋白。因此,肉桂-紫蘇精油復配抑菌保鮮劑可能是通過影響牛肉中肌紅蛋白和血紅蛋白的含量從而達到保鮮豬肉的作用。

A-亮度;B-色度;C-色調圖7 復配抑菌保鮮劑處理對貯藏中豬肉亮度、色度和色調的影響Fig.7 Effect of compound essential oil bacteriostatic agent on L*, C*, H* value of freshly cut pork in storage

3 結論與討論

本研究所選取的肉桂精油、紫蘇精油、牛至精油均是天然可食用植物的代謝產物,與化學合成物相比,都是綠色、安全、廣譜且可食用原料,均具有較好的抑菌作用。對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌而言,肉桂精油的抑菌作用最強,紫蘇精油次之,牛至精油的抑菌作用最差;將3種精油兩兩復配,除肉桂-紫蘇精油復配物對金黃色葡萄球菌的聯合抗菌作用表現為協同作用外,其余精油間的復配組合對于2種不同供試菌的聯合抗菌效果均表現為相加作用,其中,肉桂-紫蘇精油復配物對兩種供試菌種的抗菌效果最佳,且復配植物精油相比單一精油具有更加芳香、愉悅的香氣,作為天然抗菌劑在食品領域具有廣闊的應用前景。隨著人們生活水平的提高及對肉類食品的青睞,色澤均勻、鮮嫩多汁且營養豐富的鮮肉成為貨架上的寵兒,然而,鮮肉在生產及銷售的過程中極易受到微生物的污染,從而使鮮肉的品質下降,貨架期縮短,目前,對鮮肉微生物的控制措施主要集中在化學抑菌劑的應用,如添加一定濃度的山梨酸鉀或者檸檬酸可抑制微生物的生長,防止鮮肉變質和營養成分的損失[26];雖然化學抑菌劑抑菌效果良好,但是植物源抑菌劑,尤其是辛香料植物精油由于具有廣譜的抗氧化和抑菌作用,往往更受人們青睞,常被優先選作天然的抑菌原料。根據柵欄技術原理[27],將不同的植物精油進行復配,既可以發揮其協同或相加作用,增強抑菌效應,又可以減少單一精油的使用量,使每種精油的使用量保持在較低的濃度范圍內,節約成本。因此,使用復配精油對鮮切肉進行保鮮抑菌已成為肉類保鮮的必然趨勢,本研究中肉桂-紫蘇精油復配物在一定程度上可以抑制鮮切豬肉水份和蛋白質含量的損失、有效抑制大腸桿菌等微生物的生長和pH值的升高,保持鮮切豬肉的色澤和亮度,從而延長鮮切豬肉的貨架壽命。植物精油在防腐保鮮劑產業發展過程中,有著巨大的潛力,安全高效的防腐保鮮劑已經逐漸融入到我們所現有的生產中,同時還被嵌入形成腐爛后進行精準控制的技術中,這些都可以取代或減少有害的傳統化學防腐保鮮劑的使用,本次實驗可為植物精油抑菌保鮮劑的制備以及鮮切肉的抑菌保鮮提供一定理論參考。