蜜糠炒蒼術炮制工藝優選及其抗胃潰瘍作用研究 Δ

朱文婷 ，陸美霞 ，黃瑤潔 ，劉志偉 ，丁 燕 ，施林峰 ，葉喜德 （1.江西中醫藥大學附屬醫院藥學部，南昌330006；.江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004）

蒼術來源于菊科多年生植物茅蒼術Atractylodes lancea（Thunb.）DC. 或北蒼術Atractylodes chinensis（DC.）Koidz.的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效[1—2]。歷代醫籍均有記載蒼術炮制，但方法各異，如《銀海精微》為米泔制，《仙授理傷續斷秘方》為醋煮，《重刊本草衍義》為米泔浸后麩炒，《普濟方》為制炭、蒸法、茱萸制，《醫宗必讀》為糠炒等；炮制目的多為去燥，以降低藥材的副毒作用[3]。蜜糠炒蒼術為江西“建昌幫”特色炮制方法，輔料糠與藥材共制可緩和藥性，降低藥材辛燥之性和刺激性；取糠和蜂蜜拌炒（即蜜糠炒）可增強蒼術的健脾和胃之效[4]。

蒼術主要含有揮發油、萜類、聚乙烯炔類、三萜及甾體類、芳香族及糖苷類等成分，具有促胃腸道運動、抗潰瘍、抗菌、消炎、鎮痛、降血糖等多種藥理作用，可用于消化道疾病的臨床治療[5—6]。其中，揮發性成分（如β-桉葉醇、蒼術素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮等）為蒼術的主要有效成分，具有促進胃排空和小腸運動、防治胃潰瘍、保肝、利尿、抗腫瘤等作用；然而，揮發性成分過多會使蒼術產生“燥性”，而炮制則有助于減燥增效[7—9]。研究指出，麩炒蒼術可通過促進胃動素和胃泌素的分泌來增強生品的抗胃潰瘍作用[10]，然而蜜糠炒是否也具有類似增效作用，國內外尚未見報道。

逼近理想解排序（technique for order preference by similarity to ideal solution，TOPSIS）法是一種借助正、負理想解，對多屬性決策問題的供選方案進行排序的方法，與中藥多指標綜合評價的思路相符，是中藥多指標炮制工藝優化的新手段[11]。本研究擬采用正交實驗設計，以β-桉葉醇、蒼術素、白術內酯Ⅲ、蒼術酮4種揮發性成分含量為綜合評價指標，結合熵權TOPSIS 模型優選蜜糠炒蒼術的炮制工藝參數；同時，擬通過復制胃潰瘍小鼠模型，對蒼術炮制前后的抗胃潰瘍作用進行比較，旨在為該炮制品的臨床應用提供科學依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、111B型中藥粉碎機（瑞安市永歷制藥機械有限公司）、CP214 型十萬分之一分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]、Varioskan Flash型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

生蒼術（批號20211201，產地河北）購自安徽亳州藥材市場，經江西中醫藥大學藥學院中藥鑒定室劉應蛟副教授鑒定為菊科植物北蒼術A. chinensis（DC.）Koidz．的干燥根莖。

蒼術素、蒼術酮、白術內酯Ⅲ、β-桉葉醇對照品（批號分別為CHB201123、CHB201124、CHB201120、CHB201126）均購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均不低于98%；復方氫氧化鋁片（陽性對照，批號H31020657，規格為氫氧化鋁0.245 g、三硅酸鋁0.105 g、顛茄流浸膏0.002 6 mL）購自上海青平藥業有限公司；白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號分別為MM-0132M2、MM-0163M2、MM-0701M2）均購自江西阿普斯戴爾生物科技有限公司；糠（批號211213）購自江西圣田實業有限公司；煉蜜（批號153204X22）購自上海冠生園蜂制品有限公司；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純；水為純凈水。

1.3 實驗動物

SPF 級雄性昆明種小鼠90 只，體重18～20 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有動物均自由進食、飲水，適應性喂養1周后進行后續實驗。本研究的動物實驗方案經江西中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查批準，受理編號為JZLLSC20220493。

2 方法與結果

2.1 蜜糠炒蒼術的制備

按如下步驟制備蜜糠：將一定量的煉蜜和沸水倒入容器內，攪拌，得蜜水溶液；用文火將凈糠炒熱后，淋入蜜水溶液，迅速拌勻并不斷翻炒，炒至糠表皮光亮、色澤稍微加深、微粘手，取出攤涼，即得蜜糠。每100 kg 糠，用煉蜜20 kg、沸水4 kg。

按如下步驟炮制蜜糠炒蒼術：用武火將鍋底燒至一定溫度（炒制全程均控制在一定溫度范圍內），倒入蜜糠迅速翻炒至冒青煙時，將蜜糠收攏鋪平鍋底，并向周圍鋪開；立刻倒入干燥生蒼術（蜜糠和藥材按一定比例）并用周圍的蜜糠覆蓋，快速熗火翻炒一定時間至生蒼術轉微黃或黃色后，迅速出鍋，篩去蜜糠，晾涼，即得。

2.2 蜜糠炒蒼術中4種指標成分的含量測定

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素對照品適量，加入甲醇定容，制成上述4種成分質量濃度分別為0.640、0.220、0.785、0.960 mg/mL 的混合對照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取蜜糠炒蒼術樣品1 g，精密加入甲醇10 mL，混勻，稱重后超聲處理30 min，取出晾涼，再次稱重并用甲醇補足失重。同法連續提取2 次，合并提取液，移至25 mL 容量瓶中，用甲醇定容。取上述溶液適量，離心10 min后過0.22 μm微孔濾膜，取濾液，即得。

2.2.3 色譜條件

以Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～10 min，5%A→10%A；10～20 min，10%A→15%A；20～30 min，15%A→45%A；30～50 min，45%A→65%A；50～55 min，65%A→90%A；55～60 min，90%A→100%A；60～70 min，100%A→5%A）；流速為1 mL/min；柱溫為25 ℃；檢測波長為220 nm；進樣量為10 μL。

2.2.4 系統適用性考察

分別吸取空白對照溶液（甲醇）、混合對照品溶液和供試品溶液[所用蜜糠炒蒼術的炮制溫度為160 ℃，輔料與藥材比例為1∶2（g/g），炒制時間為5 min，下同]，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，供試品溶液在對照品相應保留時間處有對應色譜峰，各成分分離度良好，空白對照溶液對4種成分的測定無干擾。結果見圖1（空白對照溶液圖略）。

圖1 混合對照品溶液和供試品溶液的高效液相色譜圖

2.2.5 線性關系考察

分別吸取“2.2.1”項下混合對照品溶液100、200、300、400、500 μL，置于5 mL 容量瓶中，用甲醇定容，制成不同質量濃度的系列混合對照品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以各待測成分質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸。結果見表1。

表1 蒼術酮等4種指標成分的回歸方程和線性范圍

2.2.6 精密度試驗

取同一供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素峰面積的RSD 分別為1.29%、1.37%、1.24%、1.21%（n＝6），表明本方法精密度良好。

2.2.7 重復性試驗

取同一炮制方法下的蜜糠炒蒼術樣品，共6 份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并按外標法計算蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素含量。結果顯示，上述4種成分含量的RSD 分別為1.27%、1.37%、1.43%、1.25%（n＝6），表明本方法重復性良好。

2.2.8 穩定性試驗

取同一炮制方法下的蜜糠炒蒼術樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素峰面積的RSD 分別為1.15%、1.44%、1.03%、1.47%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.9 加樣回收率試驗

稱取已知含量的蜜糠炒蒼術樣品，共6份，分別加入與已知量相等的蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素的平均加樣回收率分別為100.34%、101.12%、98.13%、99.67%，RSD 分別為1.40%、1.34%、1.23%、1.80%（n＝6）。

2.3 蜜糠炒蒼術的工藝優化

2.3.1 工藝評價綜合評分計算

熵權法是根據多項評價指標的信息，確定各指標權重的客觀賦權法。若因素信息量越大、熵值越小，說明其對綜合評價的貢獻越大，權重也越大[11]。首先，建立原始評價指標矩陣，對數據進行歸一化處理，得概率矩陣（P*ij）；隨后，計算各指標信息熵（Sj）及權重系數（Wj），得到蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素的Wj分別為0.210 5、0.252 0、0.299 8、0.237 7；最后，按下式計算綜合評分：綜合評分＝[0.210 5×Y1/Y1（max）+0.252 0×Y2/Y2（max）+0.299 8×Y3/Y3（max）+0.237 7×Y4/Y4（max）]×100%[式中，Y1～Y4分別為蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素的實測含量；Y1（max）～Y4（max）分別為上述成分實測含量的最大值]。

2.3.2 單因素實驗

（1）輔料用量考察：取生蒼術5 份，每份100 g，固定炮制時間5 min、炮制溫度160 ℃，考察不同蜜糠用量（20、30、40、50、60 g）對綜合評分的影響。結果（表2）顯示，當蜜糠為30 g時，所得綜合評分最高。

表2 輔料用量對指標成分綜合評分的影響

（2）炒制溫度考察：取生蒼術5 份，每份100 g，固定炮制時間5 min、蜜糠用量50 g，考察不同炮制溫度（120、140、160、180、200 ℃）對綜合評分的影響。結果（表3）顯示，當炒制溫度為140 ℃時，所得綜合評分最高。

表3 炒制溫度對指標成分綜合評分的影響

（3）炒制時間考察：取生蒼術5 份，每份100 g，固定蜜糠用量50 g、炮制溫度160 ℃，考察不同炮制時間（2、3、4、5、6 min）對綜合評分的影響。結果（表4）顯示，當炮制時間為3 min時，所得綜合評分最高。

表4 炒制時間對指標成分綜合評分的影響

2.3.3 正交實驗

根據上述單因素實驗結果，本研究以輔料與藥材比例（A）、炒制溫度（B）、炒制時間（C）為因素，蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素含量的綜合評分為評價指標，利用L9（34）正交設計實驗對蜜糠炒蒼術的炮制工藝進行優化，并采用SPSS 21.0 軟件對結果進行方差分析。正交實驗的因素與水平見表5，實驗方案與結果見表6，方差分析結果見表7。由表5～表7可見，各因素對綜合評分的影響由大到小依次為B＞A＞C，且上述因素的影響均有統計學意義（P＜0.05）；最優炮制工藝為A2B2C3，即輔料與藥材比例3∶10，炮制溫度140 ℃，炒制時間4 min。

表5 蜜糠炒蒼術炮制工藝優化的因素與水平

表6 蜜糠炒蒼術炮制工藝優化的正交實驗方案與結果

表7 蜜糠炒蒼術炮制工藝優化正交實驗的方差分析結果

2.3.4 優化工藝的熵權TOPSIS模型建立及聚類分析

采用Excel 軟件對優化工藝進行熵權TOPSIS 模型分析。正理想解距離是設想的最優解，負理想解距離是設想的最劣解；歐氏貼近度（Ci）表示各方案與正理想解距離、負理想解距離之間的加權，可反映各方案與最優方案的接近程度，其值越大則方案越優，反之越劣[12]。本研究參考相關文獻[13]，通過建立初始化決策矩陣、歸一化決策矩陣、加權決策矩陣，對9批蜜糠炒蒼術正交組（表6中的S1～S9）進行熵權TOPSIS模型分析并進行綜合評分排序。結果（表8）顯示，蜜糠炒蒼術最優炮制工藝為S5 號對應的A2B2C3組合，與正交實驗優化結果一致。

表8 蜜糠炒蒼術炮制優化工藝的熵權TOPSIS模型分析

本研究進一步采用SPSS 21.0 軟件對9 批蜜糠炒蒼術正交組（表6 中的S1～S9）進行系統聚類分析。結果（圖2）顯示，當距離為20時，所有樣品可聚為兩大類，熵權TOPSIS 模型綜合評分前2 位的正交組（S3、S5）聚為Ⅰ類，其余（S1～S2、S4、S6～S9）聚為Ⅱ類，與熵權TOPSIS 模型分析結果基本一致，說明本研究建立的熵權TOPSIS模型可靠、準確，能用于蜜糠炒蒼術炮制工藝的優選。

圖2 蜜糠炒蒼術炮制優化工藝的聚類分析結果

2.3.5 工藝驗證

取生蒼術300 g，按上述最優工藝炮制蜜糠炒蒼術，平行3 份，按前述方法測定炮制品中蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素的含量并計算綜合評分。結果（表9）顯示，4種成分含量均較穩定（RSD為3.47%～5.80%，n＝3），綜合評分為95.53%～95.89%（RSD＝0.21%，n＝3），說明優選出的炮制工藝穩定、可行。

表9 蜜糠炒蒼術炮制優化工藝的驗證實驗

2.4 蒼術炮制前后抗胃潰瘍作用比較

2.4.1 藥液的制備

分別取生蒼術和按最優工藝制備的蜜糠炒蒼術樣品適量，加入3 倍量的70%乙醇，回流提取1.5 h×3 次，過濾；合并3次提取液，濃縮至無醇味，加水定容，得質量濃度均為1 g/mL（按生藥量計）的醇提液，備用。取復方氫氧化鋁片適量，研磨，加水，制成質量濃度為0.8 g/mL（按片重計）的混懸液，備用。

2.4.2 分組、造模與給藥

將昆明種小鼠隨機分為空白組，模型組，陽性對照組（復方氫氧化鋁片，1.0 g/kg），生蒼術低、中、高劑量組（1.0、1.5、2.0 g/kg，按生藥量計，下同）和蜜糠炒蒼術低、中、高劑量組（1.0、1.5、2.0 g/kg，按生藥量計，下同），每組10只。各藥物組灌胃相應藥液（劑量參考相關文獻[14—15]和前期預實驗結果設置），空白組和模型組小鼠灌胃等體積生理鹽水，每天1次，連續7 d。末次給藥60 min后，除空白組外，其余各組小鼠均灌胃無水乙醇0.008 mL/g建立胃潰瘍模型（以觀察到胃黏膜出血并可見暗紅色、條索狀潰瘍為造模成功）[16]。

2.4.3 各組小鼠血清炎癥因子比較

造模后1 h，各組小鼠摘眼球取血，血樣于4 ℃靜置1 h后，以4 000 r/min離心10 min，分離上層血清，按相應試劑盒說明書操作，采用ELISA法以酶標儀檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α 含量。采用SPSS 21.0 軟件對數據進行統計分析。結果以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。檢驗水準α＝0.05（統計方法下同）。

結果（表10）顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清IL-2 含量顯著降低，IL-6、TNF-α 含量均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組、生蒼術高劑量組、蜜糠炒蒼術中/高劑量組小鼠血清IL-2含量均顯著升高，陽性對照組、生蒼術高劑量組、蜜糠炒蒼術高劑量組小鼠血清IL-6 含量以及陽性對照組、生蒼術高劑量組、蜜糠炒蒼術中/高劑量組小鼠血清TNF-α 含量均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01），且蜜糠炒蒼術高劑量組IL-2 含量顯著高于同劑量生蒼術組，蜜糠炒蒼術中/高劑量組TNF-α 含量均顯著低于同劑量生蒼術組（P＜0.05）。

表10 生蒼術和蜜糠炒蒼術對胃潰瘍模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n＝10，pg/mL）

表10 生蒼術和蜜糠炒蒼術對胃潰瘍模型小鼠血清炎癥因子的影響（±s，n＝10，pg/mL）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與空白組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05；e：與同劑量生蒼術組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組生蒼術低劑量組生蒼術中劑量組生蒼術高劑量組蜜糠炒蒼術低劑量組蜜糠炒蒼術中劑量組蜜糠炒蒼術高劑量組IL-2 1 154.50±61.57 953.39±188.75a 1 128.19±257.68c 961.39±82.65 990.10±197.58 1 108.12±246.53c 964.15±191.64 1 022.15±91.64d 1 206.80±46.58ce IL-6 96.84±17.34 108.87±23.26b 88.04±18.12d 106.12±17.62 103.26±16.83 99.65±15.21d 102.82±22.49 98.87±22.02 94.62±15.10d TNF-α 647.31±86.81 769.64±99.92b 605.33±87.20d 746.17±146.89 737.20±118.43 718.85±90.53d 722.64±148.90 671.41±130.93de 621.22±145.59de

2.4.4 各組小鼠潰瘍指數和胃潰瘍抑制率比較

取血后，脫頸椎處死各組小鼠，取其胃組織，以生理鹽水沖洗，記錄其潰瘍灶數量并測量其長度，以潰瘍長度之和的平均值作為其潰瘍指數，并按下式計算胃潰瘍抑制率：胃潰瘍抑制率＝（模型組小鼠胃潰瘍指數-藥物組小鼠胃潰瘍指數）/模型組小鼠胃潰瘍指數×100%。

結果（表11）顯示，與空白組比較，模型組小鼠的潰瘍指數顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，陽性對照組和蜜糠炒蒼術低、中、高劑量組小鼠的潰瘍指數均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），且蜜糠炒蒼術各劑量組均顯著低于同劑量生蒼術組（P＜0.05）。生蒼術低、中、高劑量組小鼠胃潰瘍抑制率分別為9.18%、19.30%、30.70%，蜜糠炒蒼術低、中、高劑量組分別為50.32%、61.39%、53.16%。

表11 生蒼術和蜜糠炒蒼術對胃潰瘍模型小鼠潰瘍指數和胃潰瘍抑制率的影響（±s，n＝10）

表11 生蒼術和蜜糠炒蒼術對胃潰瘍模型小鼠潰瘍指數和胃潰瘍抑制率的影響（±s，n＝10）

a：與空白組比較，P＜0.01；b：與模型組比較，P＜0.01；c：與模型組比較，P＜0.05；d：與同劑量生蒼術組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組生蒼術低劑量組生蒼術中劑量組生蒼術高劑量組蜜糠炒蒼術低劑量組蜜糠炒蒼術中劑量組蜜糠炒蒼術高劑量組潰瘍指數/mm 0 3.16±1.27a 0.75±0.63b 2.87±1.57 2.55±1.53 2.19±0.83 1.57±1.49cd 1.22±1.09bd 1.48±1.21bd胃潰瘍抑制率/%76.27 9.18 19.30 30.70 50.32 61.39 53.16

3 討論

3.1 指標性成分的選擇

研究表明，蒼術中的蒼術酮、蒼術素、白術內酯Ⅲ具有利尿、保肝、抗炎等作用[16—18]，β-桉葉醇具有雙向調節腸胃功能的作用[19]。2020 年版《中國藥典》（一部）“蒼術”項下以蒼術素含量作為藥材的質量控制指標[1]。考慮到單一成分無法全面反映藥材質量，故本研究選取蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素作為蒼術炮制工藝的指標性成分。

3.2 蜜糠炒蒼術炮制工藝的篩選方法

熵權TOPSIS模型可根據多個評價指標與理想化目標的接近程度，對現有對象進行相對優劣的評價，具有計算簡便、評估合理、應用靈活等優點[20—21]。本研究采用熵權法對各指標性成分含量進行客觀賦值，并建立熵權TOPSIS模型進行綜合評價，避免了主觀偏好，使分析更為合理。炮制工藝驗證實驗結果表明，在輔料與藥材比例3∶10、炮制溫度140 ℃、炒制時間4 min的工藝條件下，蒼術酮、β-桉葉醇、白術內酯Ⅲ、蒼術素4種成分及綜合評分較穩定（RSD≤5.80%），與熵權TOPSIS模型和聚類分析結果基本一致，說明該模型可用于蜜糠炒蒼術的炮制工藝優選，所得最優工藝穩定、可行。

3.3 藥效檢測指標的選擇

胃潰瘍的發生會伴隨著一系列炎癥因子的變化。其中，TNF-α 是一種促炎因子，可在炎癥各階段調整多種炎癥因子（如IL-6、IL-2）的表達，是導致多種組織炎癥損傷和癌變的重要因素之一[22]；IL-6 可誘導黏膜血管出血及損傷，促進胃潰瘍的發生[23]；IL-2是一種多功能免疫調節細胞因子，可通過刺激效應T 細胞而增強免疫作用，可用于評估機體免疫功能[24]。因此，本研究藥效學實驗選擇了TNF-α、IL-6、IL-2這3個指標進行檢測。結果顯示，生蒼術和蜜糠炒蒼術均可不同程度地降低小鼠血清TNF-α、IL-6含量，升高血清IL-2含量，且蜜糠炒蒼術的效果較同劑量生蒼術更明顯；同時，低、中、高劑量生蒼術對小鼠胃潰瘍抑制率分別為9.18%、19.30%、30.70%，低、中、高劑量蜜糠炒蒼術對其抑制率分別為50.32%、61.39%、53.16%。這提示生蒼術和蜜糠炒蒼術均可通過抑制TNF-α、IL-6的釋放，增加IL-2的分泌，從而發揮對胃黏膜損傷的改善作用；經蜜糠炒后，蒼術的抗潰瘍作用更加明顯。

綜上所述，本研究優選的蜜糠炒蒼術炮制工藝穩定、可行；蒼術經蜜糠炒制后，抗潰瘍作用有所增強。