CDDO及其衍生物抗腫瘤作用及機制的研究進展 Δ

王夢瑩 ，張欣禹 ，杜 盼 ，陳麗艷 ， [.延邊大學醫學院腫瘤研究中心，吉林 延吉 3300；.民族地區高發腫瘤病理生物學國家民委重點實驗室（延邊大學），吉林 延吉 3300]

隨著生活條件、飲食方式及環境等因素的改變，惡性腫瘤發生率和病死率均顯著增高，因此，尋找高效、安全和低毒性的抗腫瘤藥物，提高惡性腫瘤的治療效果是值得國內外學者深入研究的課題。齊墩果酸（oleanolic acid，OA）是來源于植物的天然三萜類化合物，以游離體及皂苷的形式廣泛存在于女貞子、丁香、西洋參等多種草本植物中，其藥用價值較高，具有一定的抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性[1—3]。但由于OA存在劑型種類單一、生物利用度低以及活性弱等不足，因此，以OA作為先導物進行一系列化學結構修飾，合成其衍生物，可提高生物利用度，改善活性，加強對腫瘤細胞的選擇性，增加臨床應用價值。2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9（11）-二烯-28-羧酸（2-cyano-3，12-dioxooleana-1，9（11）-dien-28-oic acid，CDDO）為OA 的重要衍生物之一，CDDO 及其衍生物具有良好的抗腫瘤作用和開發應用前景。為此，本文總結了近年來CDDO 及其衍生物抗腫瘤作用及機制的研究成果，以期為抗腫瘤新藥研發提供理論依據。

1 CDDO及其衍生物概述

CDDO及其衍生物的合成主要以OA為先導物和前體，將分子中3個可修飾的官能團經過一系列化學結構修飾合成得到化合物CDDO，以及其C-17位取代的一系列抗腫瘤活性顯著提升的衍生物，如CDDO甲酯化合物（CDDO-Me）、CDDO 咪唑啉酮化合物（CDDO-Im）、CDDO 甲基酰胺化合物（CDDO-MA）、CDDO 乙基酰胺化合物（CDDO-EA）和CDDO 三氟甲基酰胺化合物（CDDO-TFEA）等[4—5]。化學結構式見圖1。

圖1 OA和CDDO及其衍生物的化學結構式

2 CDDO及其衍生物的抗腫瘤作用

研究表明，在體內體外實驗中，CDDO 及其衍生物對多種惡性腫瘤均表現出一定的抗腫瘤作用，能夠在較低劑量下顯著抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡和自噬、阻滯腫瘤細胞周期、抑制腫瘤細胞向遠處器官遷移和侵襲、縮小荷瘤小鼠體內移植瘤大小等[6]。

2.1 抑制腫瘤細胞增殖

CDDO-Me 又名甲基巴多索隆，是目前研究較深入的CDDO衍生物，具有顯著的多靶點抗腫瘤作用。季艷杰等[7]通過檢測CDDO-Me 對三陰性乳腺癌細胞增殖的影響，發現CDDO-Me在2.5、5、10 μmol/L濃度下以劑量依賴的方式抑制三陰性乳腺癌細胞增殖；Western blot結果顯示，CDDO-Me 通過與泛素特異性蛋白酶2a 結合，抑制其活性并下調底物β-連環蛋白（β-catenin）和腫瘤壞死因子受體相關因子6的蛋白表達水平，從而抑制三陰性乳腺癌細胞增殖和存活。Qin 等[8]研究發現，CDDOMe能夠直接與卵巢癌細胞HO8910和SKOV3中高表達的泛素特異性蛋白酶7 結合，降低其底物Mdm2 和UHRF1 表達水平；同時體內研究發現，治療組小鼠經CDDO-Me 腹腔注射給藥20 d 后，裸鼠移植瘤生長被顯著抑制。體內體外實驗均驗證了CDDO-Me對卵巢癌細胞的增殖抑制作用。以上研究顯示，CDDO衍生物能夠作為探針，通過與泛素特異性蛋白酶結合，形成一種新的泛素特異性蛋白酶非共價抑制劑，從而抑制腫瘤細胞增殖。

為尋找活性更強的CDDO相關抗腫瘤藥物，有學者通過化學結構改造設計合成了一系列CDDO 衍生物。裴江鴻等[9]以CDDO為先導物設計合成新的化合物2-氰基-3，12-二氧代齊墩果烷-1，9（11）-二烯-28-羧酸-[4-（1-嗎啉基）]丁酯，通過MTT 法和血漿穩定性實驗結果顯示，該化合物處理結腸癌HCT-116 細胞[半數抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）為1.61 μmol/L]、肺癌A549 細胞（IC50為1.16 μmol/L）及肝癌HepG2 細胞（IC50為2.19 μmol/L）與陽性對照組CDDO-Im處理HCT-116 細胞（IC50為2.82 μmol/L）、A549 細胞（IC50為1.14 μmol/L）、HepG2 細胞（IC50為2.86 μmol/L）相比，該化合物的抗腫瘤作用高于CDDO-Im。同時使用雄性SD 大鼠作為血漿穩定性實驗的驗證對象，CDDO-Im 在大鼠血漿中孵育4 h后剩余53%，該化合物剩余76%；24 h后，CDDO-Im僅余23%，而該化合物殘余量無下降，提示該化合物血漿穩定性強于CDDO-Im。以上研究表明，經過化學結構改造的CDDO 衍生物通過體外抗腫瘤活性及構效關系分析證明，CDDO酰胺類衍生物和CDDO的C-17 位上連接碳鏈長度為2 和4 的化合物活性相對較高，抗腫瘤活性均優于CDDO 或其部分衍生物，這種結構改造為合成新的抗腫瘤化合物提供了重要的依據。

2.2 誘導腫瘤細胞凋亡

細胞凋亡是細胞自身調控的主動過程，該過程具有一定的形態學特征和生物化學的改變，是一系列基因活動引起的級聯反應的結果。Samudio 等[10]研究發現，CDDO-Im處理胰腺癌細胞COLO357和PANC1后，可引起線粒體膜電位的快速下降，導致線粒體去極化，誘導胰腺癌細胞凋亡，并且凋亡細胞的核DNA 電泳圖譜呈梯狀分布，提示CDDO-Im 能通過線粒體途徑誘導胰腺癌細胞凋亡。Jeong等[11]研究發現，CDDO-Me可通過調控乳腺癌細胞內Ca2+和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平來引起內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS），CDDO-Me 能誘導乳腺癌細胞內Ca2+水平升高及內質網衍生的細胞質發生空泡化，且在升高Ca2+水平的同時CDDO-Me 誘導ROS 積累并上調磷酸化真核細胞起始因子2α和增強子結合蛋白同源蛋白等的蛋白表達，還可通過觸發ERS，導致乳腺癌細胞凋亡；此外CDDO-Me可通過下調凋亡調節蛋白表達來引起胱天蛋白酶（caspase）激活，進而誘導腫瘤細胞凋亡。Gao 等[12]研究表明，CDDO-Me 可誘導人結直腸癌細胞HCT-8、HCT-15 和HT-29 凋亡，其表現在CDDO-Me 處理細胞后，聚二磷酸腺苷核糖聚合酶-1裂解、caspase-3/caspase-8/caspase-9激活、線粒體去極化并誘導ROS產生。Ikeda等[13]研究發現，CDDO-Im是多發性骨髓瘤細胞凋亡的有效誘導劑，能夠通過破壞細胞內的氧化還原平衡，激活外源性caspase-8 依賴性的細胞凋亡途徑來加速腫瘤細胞凋亡。上述結果表明，CDDO衍生物能夠在較低劑量下通過內源性線粒體途徑、ERS途徑和caspase依賴途徑來誘導腫瘤細胞凋亡。

2.3 誘導腫瘤細胞自噬

現有研究表明，細胞自噬調節在腫瘤的發生發展中發揮“雙刃劍”作用[14]。一方面，腫瘤細胞內部出現氧氣缺乏和代謝應激時，缺氧誘導因子1α 的增加可促進腫瘤細胞自噬；另一方面，抗腫瘤藥物通過p53 途徑、RAS 途徑和microRNA 介導途徑等或調控自噬相關基因Beclin-1、微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubuleassociated protein 1 light chain 3，LC3）等機制來抑制腫瘤細胞的發生發展[15]。Wang 等[16]研究發現，CDDO-Me處理人慢性髓原白血病細胞KBM5后，自噬小體相關的蛋白LC3B 的細胞質染色增加，使CDDO-Me 能夠在自噬調節中誘導KBM5 細胞死亡。這表明CDDO 衍生物可通過細胞自噬調節而發揮抑制腫瘤的作用。

2.4 阻滯腫瘤細胞周期

腫瘤發生主要由于細胞周期調控失調，促進腫瘤細胞分裂而導致細胞無限制增殖。So 等[17]研究發現，CDDO-Im 處理三陰性乳腺癌細胞SUM159 和MDAMB-231后，通過Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染法對細胞進行染色，并通過流式細胞術測定細胞凋亡情況，結果顯示，CDDO-Im 可誘導G2/M 期細胞周期阻滯和細胞凋亡。Rogers 等[18]研究結果顯示，人骨髓瘤細胞RPMI8226 經CDDO-Im 處理后，G0/G1期細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）和CDK6 表達水平均呈劑量依賴性下調，CDDO-Im 能誘導G0/G1期細胞周期阻滯和細胞凋亡。Tsai 等[19]研究發現，CDDO-TFEA 處理多形性膠質母細胞瘤細胞GBM8401，不僅可誘導G2/M 細胞周期阻滯，還可通過抑制細胞周期蛋白B1（cyclin B1）和CDK1的表達及cyclin B1/CDK1的結合，而在體外抑制細胞增殖與細胞周期進程，最終誘發細胞凋亡。Alabran 等[20]研究顯示，CDDO-Me、CDDO-Im 和CDDO-TFEA處理人神經母細胞瘤細胞SK-N-AS后，均可使該細胞在S 期比例下降，而用CDDO-Im 處理后則在G1/G0期出現比例顯著下降并誘導細胞凋亡。以上研究提示，CDDO 衍生物能夠阻滯腫瘤細胞周期G0/G1期或G2/M期發展進程，誘導腫瘤細胞凋亡。

2.5 抑制腫瘤細胞遷移與侵襲

細胞遷移與侵襲是惡性腫瘤的兩大重要特征，也是導致腫瘤患者死亡的主要原因。Wang 等[21]研究表明，CDDO-Me 處理食管鱗狀細胞癌細胞Ec109 和KYSE70后，發現上皮細胞-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）途徑中鈣黏蛋白E 表達量明顯升高，而Snail蛋白和Slug蛋白表達量則降低，提示CDDO-Me對EMT相關蛋白的表達調控可能與細胞的侵襲能力有關。Casares 等[22]通過Transwell 侵襲實驗顯示，CDDO-TFEA和CDDO-Me 是有效的Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）和轉錄因子BTB-CNC 同源體1（BTB and CNC homology 1，BACH1）雙重抑制劑，并且它們以BACH1 依賴性和核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，NRF2）非依賴性方式減弱肺癌細胞A549 侵襲能力。Jang 等[23]研究發現，CDDO 通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ）途徑抑制12-氧-十四烷酰醇-13-乙酸酯誘發的乳腺癌轉移，使MCF-7 細胞中絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）磷酸化，下調激活蛋白1和核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）的活性，從而降低基質金屬蛋白酶9的表達；此外CDDO受獨立于PPAR-γ 的機制影響，通過Transwell 侵襲實驗發現，CDDO能夠抑制乳腺癌細胞的遷移和侵襲。以上研究表明，CDDO及其衍生物可通過EMT途徑和PPARγ途徑來抑制腫瘤細胞遷移和侵襲。

2.6 調控糖代謝重編程

為應對缺氧和低營養條件的腫瘤微環境，腫瘤細胞往往發生能量代謝的改變，即“代謝重編程”。糖酵解酶丙酮酸激酶M2 型（pyruvate kinase M2，PKM2）是Warburg效應的關鍵成分之一，是腫瘤細胞代謝的重要調節因子。Soares 等[24]研究發現，CDDO-Me 和CDDO-Im 靶向PKM2，通過劃痕實驗和Transwell 侵襲實驗發現，二者均能夠促進肺癌細胞H1299遷移，而敲除PKM2后細胞在葡萄糖和氧剝奪條件下比正常條件下遷移率顯著下降，這表明CDDO-Me可抑制PKM2活性，抑制腫瘤細胞生長。Akuetteh等[25]研究發現，CDDO-Me處理的胰腺癌細胞呈劑量依賴的方式降低細胞外酸化率，抑制細胞糖酵解能力，降低肌肉磷酸果糖激酶和PKM2 表達，提示CDDO-Me可通過誘導線粒體呼吸障礙和有氧糖酵解功能障礙來抑制胰腺癌細胞生長。目前，CDDO衍生物靶向腫瘤糖代謝可能成為一種新的腫瘤治療策略。

2.7 重塑腫瘤免疫微環境

Zhao 等[26]研究將疏水性CDDO-Me 封裝在聚乳酸-羥基乙酸納米顆粒中，并靶向遞送至晚期黑色素瘤組織的腫瘤抑制性免疫細胞MDSCs 和巨噬細胞中，與單獨靜脈給予酪氨酸酶相關蛋白2（tyrosinase related protein 2，Trp2）肽疫苗相比，聯合靜脈給予Trp2 肽疫苗和CDDO-Me 能顯著增加抗腫瘤作用和腫瘤細胞凋亡率，下調白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）、IL-6、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和轉化生長因子β等表達，減少免疫抑制細胞數量，改變基質細胞結構，顯著調節腫瘤中的免疫抑制。抗血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）生成是一種抑制腫瘤微循環方式，Ball 等[27]研究結果表明，CDDO-Me可顯著下調乳腺癌細胞中抗炎因子IL-10和VEGF的表達以及免疫抑制性腫瘤相關巨噬細胞的標志物CD206和CD115 的表達，從而抑制腫瘤發生。以上研究提示，CDDO衍生物在腫瘤微環境中能夠誘導免疫激活，為靶向腫瘤微環境、預防腫瘤細胞轉移、克服獲得性耐藥和提高治療效果提供了新視角。

3 CDDO及其衍生物抗腫瘤作用的主要信號通路

細胞內信號轉導異常與腫瘤的發生、發展及預后息息相關，多數抗腫瘤藥物可通過抑制或激活相關信號通路來影響腫瘤發生進程[28]。研究發現，CDDO 及其衍生物主要通過以下信號通路發揮抗腫瘤作用，如Janus 蛋白酪氨酸激酶（Janus protein tyrosine kinase，JAK）/信號傳導及轉錄激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路、NRF2 信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（又稱Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路、Wnt/β-catenin信號通路和NF-κB信號通路等。

3.1 JAK/STAT3信號通路

IL-6/JAK/STAT3信號通路在腫瘤中高度活化，通常與臨床預后不良相關[29]。Duan 等[30]研究發現，CDDOMe 處理紫杉醇耐藥和順鉑耐藥卵巢癌細胞胞系，可抑制IL-6 分泌、STAT3 磷酸化以及STAT3 核易位，且Western blot分析結果顯示，CDDO-Me可抑制p-STAT3和p-JAK2 表達水平，這表明CDDO-Me 可通過IL-6/JAK/STAT3信號通路來抑制耐藥卵巢癌細胞生長。Gee等[31]研究發現，乙型肝炎病毒表面大蛋白（hepatitis B virus large surface protein，LHB）的變體WW 域結合蛋白4（WW domain binding protein 4，W4P）具有致癌作用，但CDDO-Me 處理具有W4P-LHB 表達的小鼠胚胎成纖維細胞NIH3T3以及肝癌細胞HepG2和Huh7后，能夠以劑量依賴方式下調STAT3 的磷酸化表達，表明CDDO-Me能夠逆轉W4P-LHB激活的STAT3；并且CDDO-Me還能誘導細胞周期蛋白D1 的蛋白水平降低以及p21 和p53 mRNA 合成的增加，抑制STAT3 活化；同時CDDO-Me給藥后顯著抑制了裸鼠腫瘤細胞生長，證實了其抗腫瘤活性。以上研究表明，CDDO-Me 可通過抑制JAK/STAT3信號通路來發揮體內外抗腫瘤作用。

3.2 NRF2信號通路

NRF2 的激活在腫瘤中的作用是雙重的。NRF2 的過度活化在腫瘤的惡性轉化、治療耐藥和不良預后等方面的作用愈發明顯。抑制腫瘤細胞中過度活化的NRF2活性，能通過打破氧化還原平衡、拮抗腫瘤代謝、逆轉耐藥等方式發揮抗腫瘤作用[32]。Khurana 等[33]研究顯示，CDDO-Me 依賴雄激素受體（androgen receptor，AR）表達，在納摩爾濃度下處理前列腺癌細胞后，CDDO-Me瞬時誘導ROS增加，升高NRF2蛋白水平，進而激活NRF2信號通路，并誘導下游調控因子抗氧化轉錄因子AR-FL或AR-V7，降低氧化應激水平，最終抑制前列腺癌細胞的生長。Moerland等[34]研究表明，CDDO-Me作為NRF2激活劑對NRF2 野生型巨噬細胞TE-BMDMs 進行了重編程，NRF2 信號通路激活使其從腫瘤促進表型轉變為腫瘤抑制表型，體內外實驗證實了CDDO-Me 可通過激活NRF2信號通路來抑制肺癌細胞的生長。

3.3 PI3K/Akt/mTOR信號通路

PI3K/Akt/mTOR信號通路發生改變，可調控腫瘤細胞的生長、增殖、惡性轉化及代謝等。Akt、mTOR 是其信號通路中主要的抗凋亡蛋白。Deeb 等[35]研究發現，1.25 μmol/L CDDO-Me能顯著抑制人前列腺癌細胞PC-3 和C4-2 中的p-Akt、p-mTOR 水平，而2.5 μmol/L 及以上濃度的CDDO-Me能達到完全抑制效果，并且CDDOMe 還能夠抑制Akt（p-Bad，Foxo3a）和mTOR（p-S6K1，p-eIF-4E，p-4EBP1）的下游靶點表達，表明CDDO-Me可通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路抑制腫瘤細胞生長。上述研究提示，CDDO衍生物在體外可通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路對腫瘤細胞起到較強的抗腫瘤作用。

3.4 Wnt/β-catenin信號通路

β-catenin 蛋白的異常激活和過度表達均會刺激腫瘤細胞發生與發展。有報道稱，CDDO-Me 通過抑制Wnt/β-catenin 信號通路誘導乳腺癌細胞增殖及小鼠乳腺腫瘤病毒-Wnt1轉基因小鼠的腫瘤生長；CDDO-Me可直接結合低密度脂蛋白受體相關蛋白6（low-density lipoprotein receptor-related protein 6，LRP6）的細胞外結構域，誘導LRP6/卷曲蛋白家族FZD7 復合物的溶酶體降解，降低了蓬亂蛋白Dsh 同源物2 和β-catenin 磷酸化水平[36]。這提示CDDO 衍生物能通過靶向Wnt/β-catenin信號通路發揮抗腫瘤作用。

3.5 NF-κB信號通路

NF-κB 信號通路的異常是惡性腫瘤耐藥的主要機制之一，抑制NF-κB信號通路可發揮抑制腫瘤發生和增殖的作用，這已經成為抗腫瘤藥物研究的熱點之一。Shishodia 等[37]研究CDDO、CDDO-Me 和CDDO-Im 處理人慢性髓白血病細胞KBM5發現，三者均能以劑量和時間依賴的方式阻斷NF-κB 激活，抑制腫瘤細胞增殖，其中1 μmol/L CDDO-Me 抑制腫瘤細胞增殖的能力最強；Western blot 分析表明，CDDO 可以通過阻斷核因子κB抑制因子α 的產生，抑制NF-κB 信號通路激活，這提示CDDO 及其衍生物可通過NF-κB 信號通路來誘導腫瘤細胞發生快速凋亡。Stadheim 等[38]研究發現，CDDO 聯合TNF可通過NF-κB信號通路在髓系白血病細胞ML-1中表現出對聯合用藥的高度敏感；Western blot結果顯示CDDO 聯合TNF 導致caspase-8 激活，重組人BH3 結構域凋亡誘導蛋白和B細胞淋巴瘤2相關X蛋白表達水平升高，細胞凋亡顯著增加，CDDO 及其衍生物聯合TNF能夠為開發白血病治療的新方法提供基礎。以上結果提示，NF-κB信號通路或將成為CDDO及其衍生物治療惡性腫瘤的有效靶點。

4 總結與展望

CDDO及其衍生物的合成前體OA來源廣、成本低，新合成的衍生物安全性高。與單靶點抗腫瘤藥物相比，CDDO 及其衍生物的抗腫瘤作用廣泛、活性更強，能夠通過多途徑、多靶點和多機制的方式抑制多種腫瘤細胞生長。CDDO-Me 和CDDO-Im 是目前抗腫瘤活性最強的兩種半合成三萜類化合物，其中CDDO-Me在抗腫瘤、抗炎和抗氧化作用方面的研究已進入臨床試驗階段，且在應用過程中尚未出現嚴重的不良反應。

國內外研究已證實，CDDO及其衍生物能夠通過調控多靶點和多信號通路抑制腫瘤發生發展，如JAK/STAT3、NRF2、PI3K/Akt/mTOR、Wnt/β-catenin 和NF-κB等信號通路，發揮誘導腫瘤細胞凋亡與自噬，抑制增殖、侵襲、遷移，阻滯細胞周期，調控腫瘤微環境和代謝重編程等作用，展示了CDDO及其衍生物在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、黑色素瘤等多種腫瘤治療中的優勢。這種多途徑發揮抗腫瘤作用機制可有效避免機制單一，減少腫瘤細胞耐藥性的產生。未來可通過深入探究CDDO及其衍生物與多信號通路之間的相互作用，研發具有低毒、高效的新型CDDO衍生物并發掘其抗腫瘤作用機制，同時進一步優化CDDO 衍生物的新劑型，以更好地提高其生物活性和生物利用度，從而為臨床治療腫瘤提供更多的選擇。