沉默CCND1對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞5-氟尿嘧啶耐藥性的影響及機(jī)制

阮起超，陳松芝，丁浩，孫國芳，汪楊

1 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌330006；2 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心電診斷室

肝細(xì)胞癌（HCC）是常見的原發(fā)性肝癌［1-2］，具有復(fù)發(fā)率高和對(duì)抗癌藥物耐藥的特點(diǎn)，治療效果較差。5-氟尿嘧啶（5-Fu）是治療HCC的藥物之一，因獲得性耐藥限制了其臨床使用。探究HCC的5-Fu耐藥機(jī)制具有重要臨床意義。細(xì)胞周期蛋白D1（CCND1）基因編碼全酶的一個(gè)不穩(wěn)定調(diào)控亞基，參與協(xié)調(diào)細(xì)胞周期的DNA合成階段和線粒體生物合成［3］。高表達(dá)的癌基因CCND1與HCC等多種惡性腫瘤的復(fù)發(fā)和預(yù)后不良有關(guān)［4-7］。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默CCND1可抑制HCC細(xì)胞增殖，抑制HCC生長［7］。然而，關(guān)于這一癌基因與HCC化療耐藥之間的相關(guān)性尚不清楚。因此，2021年1月—2022年12月，本研究探討沉默CCND1對(duì)HCC細(xì)胞5-Fu耐藥性的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑及儀器 HCC細(xì)胞系（SMMC-7721、HepG2細(xì)胞）購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；CCND1-siRNA和NC-siRNA購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine?2000購自美國Invitrogen公司；FACS Calibur?流式細(xì)胞儀購自美國BD Biosciences公司；熒光分析儀購自芬蘭Thermo Fisher Scientific公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國Sigmae-Aldrich公司；I抗CCND1、磷酸化組蛋白（γ-H2AX）、同源重組修復(fù)蛋白（RAD51）和β-actin購自美國Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及5-Fu暴露 將HCC細(xì)胞置于杜氏改良Eagle培養(yǎng)基中，并加入10%胎牛血清、100 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素于增濕空氣中培養(yǎng)。在細(xì)胞達(dá)90%融合率時(shí)，將細(xì)胞隨機(jī)分別分為HepG2+NC-siRNA組、HepG2+CCND1-siRNA組和SMMC-7721+NC-siRNA組、SMMC-7721+CCND1-siRNA組，分別用靶向CCND1的siRNA（CCND1-siRNA）、陰性對(duì)照siRNA（NC-siRNA）轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后取各組細(xì)胞置于含10 μg/mL 5-Fu的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h。

1.3 CCND1 mRNA表達(dá)檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞。TRIzol試劑提取總RNA，按照說明書，使用PrmeScript RT試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用熒光定量PCR預(yù)混液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR：95 ℃10 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min循環(huán)40次。采用2-ΔΔCT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以β-actin作為參照基因。CCND1上游引物序列5′-CCCTCGGTGTCCTACTTCAA-3′，下游引物序列5′-GTGTTCAATGAAATCGTGCG-3′；β-actin上游引物序列5′-CGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，下游引物序列5′-TGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′。

1.4 細(xì)胞活力檢測(cè) 取各組細(xì)胞，使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。將各組細(xì)胞接種至96孔板中，加入10 μL的CCK-8試劑孵育2 h，重復(fù)3次，最后用熒光分析儀測(cè)量波長450 nm處的光密度（OD）值，取3次平均值。以O(shè)D450代表細(xì)胞活力。

1.5 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 取各組細(xì)胞，使用FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。PBS洗滌，重懸，用FITC Annexin V和PI雙重染色后，采用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞混合物。細(xì)胞凋亡率=流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖右上象限百分率+右下象限百分率。

1.6 CCND1、DNA修復(fù)相關(guān)蛋白（γ-H2AX、RAD51）表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。取轉(zhuǎn)染后及5-Fu培養(yǎng)后各組細(xì)胞，RIPA法提取總蛋白，用BCA法測(cè)定，加入樣品蛋白20 mg，10% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別加入CCND1（1∶1 000）、γ-H2AX（1∶1 000）、RAD51（1∶1 000）和β-actin（1∶5 000）一抗，4 ℃孵育過夜，加入HRP結(jié)合的二抗進(jìn)行孵育。用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行檢測(cè)，Image J軟件分析結(jié)果，目的蛋白灰度值與β-actin灰度值的比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)低（P均<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)低（P均<0.05）。見表1。

表1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)比較（）

表1 各組CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

CCND1蛋白1.00 ± 0.08 0.20 ± 0.02*1.00 ± 0.10 0.11 ± 0.05#組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組CCND1 mRNA 1.00 ± 0.19 0.22 ± 0.05*1.00 ± 0.16 0.25 ± 0.04#

2.2 各組細(xì)胞活力、凋亡率比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組5-Fu暴露72 h的OD450低（P<0.05），凋亡率高（P<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組5-Fu暴露72 h的OD450低（P<0.05），凋亡率高（P<0.05）。見表2。

表2 各組5-Fu暴露下細(xì)胞活力、凋亡率比較（）

表2 各組5-Fu暴露下細(xì)胞活力、凋亡率比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組凋亡率（%）34.26 ± 4.11 58.56 ± 6.79*47.62 ± 5.03 72.54 ± 8.41#OD450暴露12 h 0.12 ± 0.03 0.13 ± 0.05 0.12 ± 0.05 0.12 ± 0.04暴露24 h 0.22 ± 0.04 0.18 ± 0.04 0.18 ± 0.04 0.14 ± 0.04暴露36 h 0.45 ± 0.06 0.25 ± 0.03 0.34 ± 0.05 0.20 ± 0.03暴露48 h 0.62 ± 0.07 0.40 ± 0.08 0.57 ± 0.06 0.32 ± 0.08暴露72 h 0.87 ± 0.09 0.57 ± 0.07*0.74 ± 0.08 0.47 ± 0.07#

2.3 各組細(xì)胞DNA損傷修復(fù)相關(guān)蛋白表達(dá)比較 與HepG2+NC-siRNA組比較，HepG2+CCND1-siRNA組5-Fu暴露下γ-H2AX蛋白表達(dá)高（P<0.05），RAD51蛋白表達(dá)低（P<0.05）；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，SMMC-7721+CCND1-siRNA組5-Fu暴露下γ-H2AX蛋白表達(dá)高（P<0.05），RAD51蛋白表達(dá)低（P<0.05）。見表3。

表3 各組5-Fu暴露下γ-H2AX、RAD51蛋白表達(dá)比較（）

表3 各組5-Fu暴露下γ-H2AX、RAD51蛋白表達(dá)比較（）

注：與HepG2+NC-siRNA組比較，*P<0.05；與SMMC-7721+NC-siRNA組比較，#P<0.05。

RAD51蛋白1.00 ± 0.04 0.38 ± 0.05*1.00 ± 0.08 0.23 ± 0.10#組別HepG2+NC-siRNA組HepG2+CCND1-siRNA組SMMC-7721+NC-siRNA組SMMC-7721+CCND1-siRNA組γ-H2AX蛋白1.00 ± 0.10 1.70 ± 0.19*1.00 ± 0.10 6.89 ± 0.15#

3 討論

HCC是全球癌癥死亡的第4大原因，也是肝硬化死亡的主要原因［8］。HCC的預(yù)后極差，其死亡率接近世界范圍內(nèi)的發(fā)病率。在我國，HCC最常見的病因是病毒性肝炎，而國外最常見的病因是酒精性肝病。目前HCC的治療方案包括肝切除、肝移植、肝動(dòng)脈化療栓塞、化療、免疫治療、靶向治療等［1，8］。化療是HCC重要的輔助治療方法之一，但因內(nèi)在耐藥或獲得性耐藥限制了其臨床使用。HCC的耐藥機(jī)制復(fù)雜，有研究表明可能與抗癌藥物泵出腫瘤細(xì)胞的藥物外排轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá)增加、DNA損傷修復(fù)能力的增強(qiáng)、凋亡信號(hào)通路的失活、自噬、miRNA和lncRNA失調(diào)等多種因素密切相關(guān)［9-10］。其中5-Fu是全身局部化療過程中最常用的化療藥物，可阻斷胸腺嘧啶合成，從而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡［11］。因此，探究HCC的5-Fu耐藥機(jī)制具有重要的臨床意義。

癌細(xì)胞DNA修復(fù)能力高，易放療或化療耐藥，因此靶向DNA修復(fù)機(jī)制可能提高放療和化療的療效［12-13］。作為細(xì)胞周期機(jī)制的重要組成部分，CCND1在DNA修復(fù)中起重要作用，與癌癥的化療耐藥相關(guān)［14-15］。研究表明，γ-H2AX用于評(píng)估修復(fù)切口核酸酶引起的DNA鏈斷裂，RAD51用于測(cè)量同源重組在鏈間修復(fù)交聯(lián)的活性［16］。MARAMPON等［12］報(bào)道，沉默CCND1通過促進(jìn)放療誘導(dǎo)的DNA損傷而增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞的放療敏感性。在沉默CCND1誘導(dǎo)的套細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞DNA損傷中，CCND1發(fā)揮保持基因組穩(wěn)定性的重要作用［17］。ZHONG等［13］研究結(jié)果表明，沉默CCND1可以抑制RAD51并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G0/G1期阻滯，從而增加BRCA1野生型卵巢癌細(xì)胞對(duì)奧拉帕利化療的敏感性。本研究首先構(gòu)建CCND1沉默模型，并通過檢測(cè)CCND1 mRNA、蛋白表達(dá)驗(yàn)證其沉默效率。5-Fu暴露下沉默CCND1后，肝癌細(xì)胞的細(xì)胞活力下降，凋亡率上升，表明沉默CCND1增加HCC對(duì)5-Fu的敏感性。進(jìn)一步研究表明，在5-Fu暴露下，沉默CCND1升高了兩種肝癌細(xì)胞中γ-H2AX表達(dá)，降低了RAD51表達(dá)，這表明沉默CCND1可通過抑制癌細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力參與調(diào)節(jié)癌細(xì)胞對(duì)放化療的耐藥性。

綜上所述，CCND1是HCC和5-Fu抗性的關(guān)鍵介導(dǎo)因子，沉默CCND1可以通過靶向DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)HCC細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。這一發(fā)現(xiàn)為5-Fu治療難治性HCC提供了潛在治療靶點(diǎn)。