Anti-CD19Fab- （CP）3新型二聚化抗體的構建及靶向性觀察

雷曉敏，范冬梅，袁向飛，盧楊，張硯君，王建祥，熊冬生

1 中國醫學科學院血液病醫院（中國醫學科學院血液學研究所） 北京協和醫學院 天津市血液病細胞治療研究重點實驗室 實驗血液學國家重點實驗室 國家血液系統疾病臨床研究中心 細胞生態海河實驗室，天津300020；2 天津醫學健康研究院；3 天津市急腹癥器官損傷與中西醫修復重點實驗室

雜交瘤技術發明前，早期抗腫瘤免疫曾多次嘗試使用各種來源的免疫血清多克隆抗體，但由于抗體親和力或者腫瘤特異性較差以及難以獲得大量抗體以失敗告終［1］。隨著單克隆抗體技術愈發成熟，用于癌癥治療的商業單抗快速進入市場，但全長抗體分子量較大，難以穿透腫瘤組織到達腫瘤部位，且Fc段易引起非特異性結合等缺點，因此構建小分子抗體（如單價可變區片段scfv［2］、抗原結合片段Fab、單域抗體等）對于臨床應用具有十分重要的意義。與單價小分子抗體相比，設計雙價或多價抗體可以增強與抗原表位結合力［3-4］、減緩在體內的清除速率、延長藥物代謝半衰期。目前，常見的多價抗體主要有Diabodies、Triabodies、Tetrabodies、F（ab′）2等［5-6］。近年來隨著基因工程抗體技術的發展，人源化嵌合抗體可保留鼠源的抗原結合區，又可降低免疫原性，正被深入研究并廣泛應用［7-8］。2021年5月—2022年6月，本課題組擬通過基因工程方式構建一種新型的二聚化比例更高的嵌合抗體，以達到增強與抗原親和力的目的。

1 材料與方法

1.1 主要材料 PAYZ-Anti-CD19Fab載體由本室構建并保存；大腸桿菌16C9由本室保存；人B細胞淋巴瘤細胞系Raji由本室凍存，在含有10%胎牛血清及2 mmol/L的L-谷氨酰胺的RPMI1640（購于Gilbco公司）培養基中培養，培養條件為5%C02、37 ℃、飽和濕度；Protein G親和層析柱購于GE公司；10 kD超濾濃縮管購于Merck公司；BCA定量試劑盒購于Thermo公司；PE/CY5標記的小鼠抗人IgG抗體購自abacm公司；PD-1鼠源抗體購自曠博生物；APC標記的抗鼠IgG F（ ab’）2抗體購自CST公司；CD19親本鼠源全抗購自曠博生物。

1.2 抗體的表達純化與鑒定

1.2.1 PAYZ-Anti-CD19Fab-（CP）3、PAYZ-Anti-CD19Fab-（CPP）3的構建 PAYZ-Anti-CD19Fab載體中VL、VH分別連接在人源CL、CH1的N端，通過限制性內切酶ApaI及SphI酶切載體PAYZ-Anti-CD19Fab；利用基因克隆技術分別將合成的基因片段CH1-（CP）3、CH1-（CPP）3與載體PAYZ-Anti-CD19Fab連接，構成表達載體PAYZ-Anti-CD19Fab-（CP）3及PAYZ-Anti-CD19Fab-（ CPP）3。

1.2.2 Anti-CD19Fab（-CP）3、Anti-CD19Fab（-CPP）3、Anti-CD19Fab表達 將構建好的PAYZ-Anti-CD19Fab-（CP）3、PAYZ-Anti-CD19Fab-（CPP）3、PAYZ-Anti-CD19Fab質粒各25 ng通過熱激法轉化至感受態大腸桿菌16C9中，隨機挑取單菌落于10 mL 2-YT培養基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養14 h。取小搖菌液2 mL接種于200 mL 2-YT培養基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養8 h；8 000 r/min，4 ℃離心30 min收集菌體棄上清，將菌體輕輕重懸于400 mL低磷AP5培養基中，37 ℃、200 r/min誘導表達24 h；8 000 r/min、4 ℃離心30 min收集菌體棄上清，將菌體在-80 ℃冰箱和室溫下反復凍融3次，加入20 mL周質腔蛋白提取液重懸，冰上100 r/min，裂解1 h；8 000 r/min、4 ℃離心30 min，收集上清。

1.2.3 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3、Anti-CD19Fab的分離純化 將所獲上清于7 000 Da的透析袋中置于磷酸鹽緩沖液（PBS）中4 ℃下透析24 h（每3～6 h換液1次），4 000 r/min、4 ℃離心10 min，上清經0.45 μm濾膜過濾，上樣于Protein G親和層析柱；經PB buffer平衡后用pH 2.8～3.0的甘氨酸溶液洗脫，pH 9.0的Tris-HCL緩沖液中和，于10 kDa的超濾濃縮管中濃縮并用PBS置換3次至體積為1 mL。采用PierceTMBCA蛋白分析試劑盒定量后，Anti-CD19Fab-（CP）3為3.95 mg/L， Anti-CD19Fab-（CPP）33.15 mg/L，Anti-CD19Fab為5.5 mg/L。

1.2.4 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3的二聚化鑒定 取純化后蛋白各10 μg分別與上樣緩沖液混合后于95～100 ℃金屬浴中10 min，其中還原性的樣品中另加入了終濃度2%的巰基乙醇，經12%SDS-PAGE、考馬斯亮藍R250染色5 min，脫色液脫色16 h以上，SDS-PAGE電泳法可顯示出清晰的條帶。用Image J圖像分析軟件對非還原電泳圖進行掃描分析，可粗略得出高分子量組分在純化后蛋白樣品中所占的百分含量比。選擇Anti-CD19Fab-（CP）3蛋白，采用液相色譜串聯質譜法（LC-MS）進一步精確檢測Anti-CD19Fab-（CP）3蛋白樣品中各組分的分子量及相對含量。取Anti-CD19Fab-（CP）3純品，于4 ℃、12 000 r/min速度下離心10 min，收集上清液至新的離心管中備用。根據設置好的液相色譜和質譜條件，完成LC-MS鑒定。

1.3 抗體對CD19高表達細胞系Raji的靶向性觀察

1.3.1 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3、Anti-CD19Fab與CD19高表達細胞系Raji直接結合試驗 抗體以終濃度0.135、0.675、1.35 μg/mL分別與5×105個對數生長期Raji細胞室溫共孵育30 min，1 500 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2次；100 μL PBS重懸細胞，以PE/CY5標記的小鼠抗人IgG抗體作為二抗，每管0.8 μL，室溫避光孵育30 min，1 500 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗兩次，將細胞重懸于400 μL PBS中。同時設置空白對照管及二抗對照管，FACS測定熒光強度并繪圖。

1.3.2 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3、Anti-CD19Fab與CD19親本鼠源全抗競爭結合試驗 取抗體使其終濃度為9 μg/mL（低濃度）、27 μg/mL（中濃度）、81 μg/mL（高濃度），同時分別加入終濃度與抗體相同的PD-1鼠源全抗，以消除CD19親本鼠源全抗Fc端與細胞的非特異性結合而減弱抗體競爭力的影響；再加入終濃度15 μg/mL的CD19親本鼠源全抗，共同與5×105個對數生長期Raji細胞進行孵育。室溫孵育30 min，1 500 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2次；200 μL PBS重懸細胞，加入APC標記的抗鼠IgG F（ab’）2抗體1 μL；室溫避光孵育30 min，1 500 r/min離心8 min，棄上清，PBS洗2次，將細胞重懸于400 μL PBS中。同時設置空白對照管、陽性對照管（未競爭）、二抗對照管、非特異性同型對照管， FACS測定熒光強度。

1.4 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0統計軟件。計量資料采用Shapiro-Wilk正態性檢驗呈正態分布以表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3高分子量聚體組分 SDS-PAGE電泳法顯示純化后的Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3電泳條帶位置均相同（見圖1）。從圖1a非還原條件的電泳圖中可看出，與Anti-CD19Fab相比，Anti-CD19Fab-（CP）3和Anti-CD19Fab-（CPP）3均形成了高分子量的聚體（①位置對應的條帶），且Anti-CD19Fab-（CP）3所形成的高分子量聚體明顯高于對照蛋白Anti-CD19Fab-（CPP）3。根據Image J圖像分析掃描結果，粗略得到Anti-CD19Fab-（CP）3的高分子量聚體組分在其樣品中占比為（57.18± 1.17）%，而Anti-CD19Fab-（CPP）3的高分子量聚體組分在其樣品中占比為（22.52± 0.96）%，二者比較差異有統計學意義（P<0.05）。此電泳結果說明引入 （CP）3結構比 （CPP）3結構更易形成高分子量聚體。

圖1 三種抗體電泳圖

2.2 Anti-CD19Fab-（CP）3單體、二聚體分子量 LCMS鑒定結果見圖2。已知Anti-CD19Fab-（CP）3的單體氨基酸數為450，理論分子量為48 543.3 Da，與圖2中②48 724.5 Da相對應，該組分為單體形式。圖2中①峰分子量為97 088.4 Da，由單體理論值推測該組分為二聚體形式。另該方法鑒定結果顯示：①在樣品中所占比例為76.2%，②在樣品中所占比例為18.4%。由于LC-MS結果可表示峰高與樣品中的組分含量呈正相關，即圖2標注的①、②對應圖1a的①、②，聚體所占比例亦與電泳結果相符。綜上結果可知，①為二聚體，②為單體。結合電泳結果可說明，相比于在CH1的C端引入的 （CPP）3結構，（CP）3結構形成的二聚體含量更高（P均<0.05）。

圖2 Anti-CD19Fab-（CP）3單體、二聚體分子量

2.3 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3、Anti-CD19Fab與Raji細胞直接結合能力 直接結合實驗表明，抗體與細胞的結合能力隨抗體濃度升高呈劑量依賴性，且同濃度下Anti-CD19Fab-（CP）3親和能力強于Anti-CD19Fab-（CPP）3及Anti-CD19Fab（P均<0.05）。見圖3。

圖3 不同濃度抗體與Raji細胞結合能力

2.4 Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3、Anti-CD19Fab與CD19親本鼠源全抗競爭力 競爭性免疫熒光結合實驗顯示，Anti-CD19Fab-（CP）3、Anti-CD19Fab-（CPP）3和Anti-CD19Fab隨使用濃度增高，對親本CD19抗體的競爭逐漸增強。中濃度（27 μg/mL）時Anti-CD19Fab-（CP）3對親本抗體的競爭率為（57.8± 2.12）%，高濃度（81 μg/mL）時為（78.1± 1.34）%；中濃度、高濃度時，Anti-CD19Fab-（CPP）3對親本抗體的競爭率分別為（49.6± 0.94）%、（74.3± 1.13）%，Anti-CD19Fab分別為（14.4±0.59）%、（54.2± 0.74）%。改構后的Anti-CD19Fab-（CP）3對親本CD19的親和力強于Anti-CD19Fab-（CPP）3及Anti-CD19Fab（P均<0.05）。

3 討論

本研究構建的是小分子雙價抗體F（ab’）2，無Fc段，可在原核表達系統大腸桿菌中表達［9］；此表達系統成本低、周期短，易于操控。實驗中，我們通過在Anti-CD19Fab嵌合抗體的CH1的C末端引入 （CP）3結構，其中脯氨酸提供空間位阻，以防止3個半胱氨酸相鄰形成鏈內二硫鍵；1個Fab的半胱氨酸的-SH可與另1個Fab的-SH通過氧化形成二硫鍵，將2條重鏈共價連接在一起，進而形成二價同源抗體分子F （ab’）2。另外，本課題組亦構建了在CH1的C末端引入 （CPP）2、（CPP）、（CP）2、（CP）結構，形成二聚化的比例均沒有引入 （CP）3結構高。

多價抗體的構建可通過亮氨酸拉鏈法［10］、連接肽法、蛋白酶消化IgG［11］等方式獲得F（ab’）2。本實驗室前期工作通過引入IgG的恒定區CH3，通過CH3與CH3之間的非共價鍵相互作用構建抗CD19的二聚化蛋白，成功獲得了二聚化的抗體［12］。與以上不同的是，本文意在通過形成共價鍵的方式構成二聚化蛋白。蛋白二硫鍵的形成對于蛋白折疊及穩定二級結構發揮著十分重要的作用［13］，且通過二硫鍵形成的多聚蛋白更穩定，半衰期更長［14］。此外，有研究報道二硫鍵的引入不僅可以保持蛋白的穩定性，也可用于修飾或改善蛋白質功能［15-16］。由此可見，基因工程引入二硫鍵對于蛋白結構和功能的研究意義重大。

本研究先通過SDS-PAGE法初步判斷是否形成了高分子量聚體及Anti-CD19Fab-（CP）3與Anti-CD19Fab-（CPP）3各自形成聚體的比例，但由于非還原狀態的電泳不能反映實際的二聚化蛋白分子量，因此我們后續又通過LC-MS方法進一步鑒定蛋白分子量，最終確定了目的蛋白確為二聚化蛋白，與預期分子量相符。接著我們通過流式細胞術檢測二聚化蛋白的靶向性，發現與現有的二聚化蛋白Anti-CD19Fab-（CPP）3、單體蛋白Anti-CD19Fab相比，Anti-CD19Fab-（CP）3與抗原的結合力及親和力均更強，此結果也符合非還原電泳圖中的二聚體所占比例越高，對靶細胞的靶向性越強。為驗證引入（CP）3結構是否可在不同的靶點上通用，本課題組后續進行了在Anti-CD20及Anti-BCMA靶點的工作，也得出了相同的結論，即引入 （CP）3結構的二聚化蛋白與靶細胞的親和力明顯強于引入 （CPP）3結構的二聚化蛋白。因此，我們可認為通過基因工程引入的（CP）3結構為構建雙價抗體提供了更優的選擇。