直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1表達與患者臨床病理特征及預后的關系

楊文彬，蔣宗霖，張堅，馬琳

1 青島市第八人民醫院肛腸外科，山東青島266100；2 青島大學附屬醫院（平度）胃腸外科

結直腸癌是胃腸道常見惡性腫瘤。近年來隨著生活習慣的改變和人口平均壽命的延長，結直腸癌發病率呈持續上升趨勢，據流行病學統計，2022年我國新發結直腸癌病例592 232例，死亡309 114例［1］。盡管近年來直腸癌的診治取得一定進展，但患者預后仍然較差［2-3］，因此探索直腸癌發病機制對預后改善至關重要。研究表明，微小RNA（miRNA）等非編碼RNA作為獨特的RNA轉錄本，參與直腸癌細胞各種行為調控［4］。miR-128-3p與口腔鱗狀細胞癌、結腸癌等惡性腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移有關［5-6］。釉叢蛋白1（TUFT1）是一種酸性蛋白，能通過激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路促進腫瘤細胞惡性行為進展［7］。目前關于miR-128-3p、TUFT1與直腸癌關系的報道較少，本研究擬探討直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1表達與患者臨床病理特征及預后的關系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年7月—2020年1月青島市第八人民醫院收治的102例直腸癌患者，男58例、女44例；年齡34～81（60.42 ± 5.83）歲；腫瘤直徑≥4 cm 66例、<4 cm 36例；腫瘤分化程度為低分化66例、中高分化36例；TNM分期［8］Ⅰ～Ⅱ期44例、Ⅲ期58例；淋巴結轉移50例。納入標準：經病理檢查確診為直腸癌；患者及家屬簽署知情同意書；行姑息或根治性手術。排除標準：非初次確診或已接受抗腫瘤治療；合并其他部位惡性腫瘤；年齡<18歲；合并急慢性感染；合并免疫、血液、神經系統損害；院內死亡、拒絕隨訪、失訪、臨床資料不完整。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達檢測 術中收集患者癌組織及其癌旁組織（距離癌組織>3 cm并經病理檢查證實為正常組織），液氮下研磨組織標本，TRIzol法（杭州昊鑫生物科技股份有限公司）提取組織總RNA，TaKaRa RNA PCR Kit試劑盒（北京麥瑞博生物科技有限公司）逆轉錄合成cDNA，條件42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。以cDNA為模板，參考SYBR?Premix Ex Taq?試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司）說明書，用實時熒光定量PCR分析儀［賽默飛世爾科技（中國）有限公司］進行擴增，反應體系共20.0 μL：cDNA模板1.0 μL、2×Master mix 8 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、SYBR Premix Ex Taq 5.0 μL、RNase-free ddH25.0 μL；反應條件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 15 s循環40次。miR-128-3p、TUFT1分別以U6、GAPDH為內參校正，2-ΔΔCT法計算組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA相對表達量。miR-128-3p上游引物序列5′-CAGCATCACTGGCCAAGGAGCTGA-3′，下游引物序列5′-GACCACACTGATGACTCCTGTGTTCC-3′；TUFT1上游引物序列5′-AAAGGACGCCACCATCCAG-3′，下游引物序列5′-GTGCTGAAGTTGCCATGACTG-3′；U6上游引物序列5′-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3′，下游引物序列5′-AAATATGGAACGCTTCACGA-3′；GAPDH上游引物序列5′-AACGGGAAGCTCACTGGCATG-3′，下游引物序列5′-TCCACCACTGTTGCTGTAG-3′。

1.3 隨訪 出院后通過電話或門診隨訪直腸癌患者3年，第1年3個月1次，以后6個月1次。隨訪至患者死亡或2023年1月。根據直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達均值將患者分為高、低表達組，比較累積生存率。

1.4 統計學方法 采用SPSS28.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗；符合正態分布的計量資料以表示，兩組比較采用t檢驗；Pearson相關法分析直腸癌組織中miR-128-3p與TUFT1 m RNA的關系；用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，累積生存率比較采用Log-rank方法；直腸癌患者死亡的影響因素采用多因素Cox回歸分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直腸癌組織、癌旁組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達比較 與癌旁組織比較，直腸癌組織中miR-128-3p表達低，TUFT1 mRNA表達高（P均<0.05）。見表1。

表1 直腸癌組織、癌旁組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達比較（）

表1 直腸癌組織、癌旁組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達比較（）

組別癌組織癌旁組織P miR-128-3p 0.867 ± 0.187 1.463 ± 0.324<0.05 TUFT1 mRNA 1.776 ± 0.469 1.052 ± 0.267<0.05

2.2 直腸癌組織中miR-128-3p與TUFT1 mRNA表達的相關性 Pearson相關分析顯示，直腸癌組織中miR-128-3p與TUFT1 mRNA表達呈負相關（r=-0.752，P<0.05）。

2.3 直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系 直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關（P均<0.05），與患者性別、年齡、腫瘤最大徑無關（P均>0.05）。見表2。

表2 直腸癌組織中miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達與患者臨床病理特征的關系

2.4 miR-128-3p、TUFT1 mRNA表達與直腸癌患者預后的關系 102例直腸癌患者隨訪3年，死亡30例，累積生存率為70.59%（72/102）。miR-128-3p高、低表達組3年累積生存率分別為84.91%（45/53）、55.10%（27/49），比較差異有統計學意義（P<0.05）；TUFT1 mRNA高、低表達組3年累積生存率分別為56.86%（29/51）、84.31%（43/51），比較差異有統計學意義（P<0.05）。

2.5 直腸癌患者死亡的影響因素 排除失訪3例患者，根據直腸癌患者存活狀況分為死亡組與存活組，將表3單因素分析有差異因素作為自變量，隨訪時間為時間變量，生存狀態（賦值：死亡為“1”；存活為“0”）為因變量，多因素Cox回歸模型分析顯示，直腸癌患者死亡的獨立危險因素為低分化、TNM分期Ⅲ期、淋巴結轉移、TUFT1 mRNA高表達，獨立保護因素為miR-128-3p高表達（P均<0.05）。見表4。

表3 影響直腸癌患者死亡的單因素分析

表4 影響直腸癌患者死亡的多因素Cox回歸分析

3 討論

直腸癌是起源于直腸黏膜上皮細胞的惡性腫瘤，以便血、大便習慣改變、腸道狹窄或梗阻等為主要臨床表現，盡早診斷和切除直腸癌病灶是降低患者病死率的有效措施，但由于直腸癌早期癥狀并不典型，導致我國大多患者在初診時處于中晚期，Ⅰ期診斷率僅13.9%［9］。目前，手術仍然是直腸癌早期最有效的治療措施，盡管近年來免疫和靶向治療取得長足進展［10］，但晚期直腸癌極易發生肝、腦、腹膜等部位轉移，且隨著免疫和靶向治療時間的延長，獲得性耐藥和不良反應也越來越多，導致直腸癌患者預后仍然不容樂觀［11-13］。

直腸癌的發生、發展是多因素、多基因、多步驟參與的復雜過程，miRNA作為一類新興表觀遺傳調控分子，能通過與mRNA完美互補或不完美配對引發mRNA降解或轉錄后基因沉默，作為促癌或抑癌基因參與直腸癌的發生、發展［14］。miR-128-3p定位于人染色體2q21.3，徐玉紅等［15］研究報道，miR-128-3p能靶向下調鋅指E盒同源結合蛋白1表達，抑制卵巢癌細胞上皮-間充質轉化。miR-128-3p能靶向下調GATA結合蛋白2表達，以抑制Ras同源家族成員A信號通路，進而抑制肺癌細胞增殖、侵襲和上皮間質轉化［16］；能靶向下調具有CCCH鋅指結構域的蛋白質12D表達，促進骨肉瘤細胞增殖、侵襲和抑制凋亡［17］。上述研究表明，miR-128-3p在不同類型腫瘤中發揮促癌或抑癌基因作用，但關于其與直腸癌的關系尚不清楚。本研究結果顯示，直腸癌組織中miR-128-3p低表達，與分化程度、TNM分期和淋巴結轉移有關，說明miR-128-3p低表達與直腸癌發生、發展有關。miR-128-3p在直腸癌中低表達可能與其啟動子被甲基化而表達沉默有關［18］。隨著miR-128-3p表達降低，能上調叉頭箱蛋白O4表達，激活轉化生子因子-β/母親對抗十肢癱瘓同源基因和Janus激酶/信號轉導和轉錄激活因子3信號通路，促進直腸癌細胞上皮間質轉化，進而促進其惡性進展［19］。

PI3K/AKT信號通路是由受體酪氨酸激酶激活導致PI3K復合物活性增加，將磷脂酰肌醇4，5-二磷酸轉化為磷脂酰肌-3，4，5-三磷酸并激活AKT，是直腸癌中常被激活的一條信號通路，能促進直腸癌細胞增殖、分化、遷移、侵襲、血管生成，并增強直腸癌細胞對放化療免疫治療、靶向治療的耐藥性［20-21］。TUFT1是成釉細胞合成并分泌到牙釉質基質中的一種酸性蛋白質。研究發現，TUFT1參與釉質礦化，還能增強AKT磷酸化，激活PI3K/AKT信號通路，在腫瘤發生、發展中發揮重要作用［7］。LIN等［22］研究報道，TUFT1表達上調能激活PI3K/AKT信號通路，促進腎細胞癌細胞增殖和遷移，使用PI3K抑制劑抑制AKT磷酸化能減弱TUFT1的促癌作用。DOU等［23］研究報道，TUFT1表達上調能激活PI3K/AKT信號通路，促進肝細胞癌的生長和轉移，敲低TUFT1能阻斷其促癌作用。本研究結果顯示，直腸癌組織中TUFT1 mRNA高表達，與患者病理特征有關，說明TUFT1 mRNA高表達參與直腸癌發生、發展。TUFT1 mRNA在直腸癌中高表達可能與其啟動子被癌基因激活有關，隨著TUFT1 mRNA表達上調能激活PI3K/AKT信號通路，促進直腸癌惡性進展。YANG等［24］實驗也證實，TUFT1能激活PI3K/AKT信號通路，促進直腸癌細胞遷移和侵襲，并增強其耐藥性。

本研究發現，miR-128-3p與TUFT1直腸癌組織中表達呈負相關，說明miR-128-3p和TUFT1可能共同參與直腸癌發生、發展。有研究發現，miR-128-3p能靶向下調TUFT1表達，抑制胃癌細胞增殖，促進其凋亡［25］。但關于miR-128-3p和TUFT1是否共同參與直腸癌進展還需進一步實驗證實。本研究結果顯示，高miR-128-3p表達和低TUFT1 mRNA表達的直腸癌患者3年累積生存率明顯升高，二者均是直腸癌患者死亡的獨立影響因子，說明直腸癌組織中miR-128-3p低表達和TUFT1 mRNA高表達還與患者預后有關，可能成為直腸癌診治的新靶點。

綜上所述，直腸癌組織中miR-128-3p低表達、而TUFT1高表達，與直腸癌的發生、發展有關。但本研究結果還需多中心研究證實。