柏苓顆粒的降尿酸效果及其初步作用機制

丁飛艷, 鄭茗冉, 吳振, 王立強, 侯志勇,3

(1. 華僑大學 生物醫學學院, 福建 泉州 362021;2. 廈門大學 藥學院, 福建 廈門 361102;3.中國人民解放軍聯勤保障部隊第962醫院, 黑龍江 哈爾濱 150086)

血清尿酸鹽濃度過高是痛風發生的最重要因素,人的血尿酸飽和閾值是0.408 moL·L-1,臨床診斷的高尿酸血癥(HUA)即血尿酸濃度達到或超過飽和閾值.當血尿酸濃度持續超過飽和閾值,且沒有及時治療時,血漿中會析出尿酸鈉晶體,高尿酸血癥會進一步導致慢性痛風[1].在中藥復方治療HUA的應用中,不僅可以通過辨證下藥給患者提供多元化治療選擇,而且配伍加減可以在很大程度上增強治療效果,減少可能存在的副作用[2-3].柏苓湯劑是國內醫院院內制劑,全方由黃柏、蒼術、土茯苓、薏苡仁、雞血藤、忍冬藤、甘草與牛膝組成,黃柏、蒼術清濕熱、除實火為君藥,薏苡仁、土茯苓祛濕除痹為臣藥,忍冬藤、雞血藤祛風通絡、清熱活血為佐藥,甘草、牛膝補益肝腎為使藥.全方共奏祛風除濕、退痹通絡之效,是治療HUA與急性痛風性關節炎的復方制劑.為改善柏苓湯劑的應用性,本文對柏苓顆粒的降尿酸效果及其初步作用機制進行研究.

1 實驗材料

1.1 實驗試劑

柏苓顆粒(實驗室自制);氧嗪酸鉀(上海市穎心實驗室生產);非布司他(浙江省杭州市朱養心藥業有限公司);黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒、腺苷脫氨酶(ADA)檢測試劑盒、尿酸(SUA)試劑盒、肌酐(Cr)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒(江蘇省南京市建成科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(安徽省淮南市山河藥輔有限公司);乙醚(上海市國藥集團);質量分數為10%的水合氯醛、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶(HGPRT)試劑盒、有機陰離子轉運體1(OAT1)抗體、尿酸陰離子轉運體1(URAT1)抗體(廣東省深圳市華諾生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(強)、5×蛋白上樣緩沖液、增強型化學發光(ELC)試劑盒(河南省鄭州市普利萊生物科技有限公司);快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(北京市莊盟國際生物基因科技有限公司).

1.2 實驗儀器

TGL-16型臺式高速冷凍離心機(上海市亞速旺公司);InfiniteM 200型多功能酶標儀(瑞士帝肯公司);DYY-74型電泳儀(北京市六一儀器廠);LC-SFJ-10型手持式高速勻漿機(上海市力辰邦西儀器科技有限公司);凝膠成像儀(北京市大龍儀器有限公司).

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠質量為(200±20) g(福建省福州市吳氏實驗動物貿易有限公司),許可證號為SCXK(京)2019-0008.

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

柏苓顆粒的人用劑量為70.00 g·d-1,大鼠臨床等效劑量為6.30 g·kg-1(根據體表面積等效劑量折算表[4]),柏苓顆粒高、中和低劑量組劑量分別按大鼠臨床等效劑量的4,2和1倍進行設置,分別為25.20,12.60,6.30 g·kg-1.氧嗪酸鉀與非布司他不溶于水,均使用質量分數為1.2%(稱取6.00 g羧甲基纖維素鈉,加熱攪拌溶解于500 mL蒸餾水)的羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液給藥.稱取3.00 g氧嗪酸鉀,溶于100 mL的羧甲基纖維素鈉溶液,制得氧嗪酸鉀混懸液,以0.30 g·kg-1劑量給藥.將非布司他研碎成細粉末,稱取0.18 g非布司他粉末.溶于500 mL的羧甲基纖維素鈉溶液,制得非布司他混懸液,以0.003 6 g·kg-1劑量給藥.所有藥物均當天現配.

2.2 分組與造模給藥

將42只雄性大鼠隨機分為7組,分別為空白組、模型組、陽性對照組(非布司他組)、柏苓湯劑組、柏苓顆粒高、中、低劑量組.大鼠HUA模型建立如下：給空白組大鼠灌胃蒸餾水,其余各組大鼠灌胃氧嗪酸鉀混懸液,每天給藥1次,連續造模10 d;最后一次灌胃1 h后,使用乙醚麻醉,對眼眶進行采血并檢測SUA濃度;統計分析后,確定造模成功,即所有模型組大鼠的SUA濃度與空白組大鼠的差異有統計學意義(P<0.05),停止造模并開始給藥;給空白組和模型組大鼠灌胃蒸餾水,給其余實驗組大鼠灌胃相應劑量的藥物,每天給藥1次,連續14 d.

2.3 狀況的觀察

從實驗造模開始,在第1,10,17,24天稱取大鼠的體質量,同時觀察大鼠的活動、行為狀態,飲食飲水量及尿液糞便排泄情況.

2.4 血清尿酸濃度的測定

造模第10 d,給大鼠灌胃氧嗪酸鉀1 h后,使用乙醚麻醉,采用0.05 mm毛細管取1 mL的眼眶血,常溫條件下靜置2 h,析出血清,于3 500 r·min-1低速離心10 min(4 ℃),分離得到血清,參照SUA試劑盒說明,每個樣本設置3個復孔,平行測定3次血清給藥前SUA濃度并取平均值.

末次分組灌胃給藥后,各組大鼠禁食不禁水過夜,按大鼠體質量每100 g腹腔注射水合氯醛1 mL進行麻醉,心臟取血后,靜置2 h,于3 500 r·min-1低速離心10 min(4 ℃),分離得到血清,參照SUA試劑盒說明,將每個樣本設置3個復孔,平行測定3次血清給藥后SUA濃度并取平均值.

2.5 血清ADA和XOD活性的測定

參照ADA和XOD試劑盒說明,每個樣本設置3個復孔,平行測定3次血清ADA和XOD活性并取平均值.

2.6 肝臟ADA,XOD與HGPRT活性的測定

將肝組織用磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)洗去表面血漬,將肝組織與質量分數為0.9%生理鹽水按質量體積比為1∶9的比例進行混合,在冰上充分勻漿,于3 500 r·min-1分離兩次,每次5 min.取上清液,參照XOD,ADA與HGPRT試劑盒說明,分別測定肝組織上清液OD值,每個樣本設置3個復孔,平行測定3次肝臟給藥后XOD,ADA與HGPRT活性并取平均值.

2.7 血清Cr和BUN濃度的測定

參照肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)試劑盒說明,每個樣本設置3個復孔,分別平行測定3次血清Cr和BUN濃度并取平均值.

2.8 腎臟OAT1和URAT1蛋白相對表達水平的測定

將腎組織與裂解液按質量體積比為1∶10的比例混合,于冰上裂解,再使用勻漿機進行間隔10 s勻漿3～5 s的處理,充分裂解30 min,置于3 500 r·min-1(4 ℃)條件下離心兩次,每次5 min,取上清液勻漿蛋白,總蛋白質量濃度使用BCA試劑盒測定.將各樣品與蛋白上樣緩沖液按質量體積比為4∶1的比例混勻,煮沸10 min,變性后,放于4 ℃保存.按照凝膠制備試劑盒的使用說明制膠,并以120 μg蛋白上樣量進行蛋白凝膠電泳,并采用濕轉法進行轉膜.使用質量分數為5%的脫脂奶粉室溫封閉膜1 h,加入一抗,于4 ℃下孵育過夜;再次洗膜后,加入HRP標記的二抗充分覆蓋膜表面,室溫孵育1 h;最后,使用 ECL進行發光顯影,用ImageJ軟件分析各目標條帶的灰度值并進行統計分析,使用β-actin作為內參蛋白,觀察并計算各組OAT1和URAT1蛋白相對表達水平.

2.9 統計學處理

3 實驗結果與分析

3.1 大鼠狀況

實驗過程中,各組大鼠行為活潑,反應迅速,精神良好,毛發光潔干燥,進食、飲水量保持正常.造模期間,所有大鼠糞便軟硬程度適中,除空白組外,灌胃氧嗪酸鉀的大鼠尿液偏黃,尿液增多.在給藥期間,所有大鼠糞便軟硬程度適中,除模型組大鼠尿液偏黃外,其他組大鼠尿液顏色正常.實驗期間,所有大鼠體質量有所增長.大鼠體質量的變化情況,如圖1所示.圖1中：m為大鼠質量;t為天數;高、中、低劑量組分別為柏苓顆粒高、中、低劑量組.由圖1可知：在同一時間內,與空白組相比的模型組、非布司他組、柏苓湯劑組及柏苓顆粒高、中、低劑量組大鼠體質量差異不具有統計學意義(P>0.05),說明各實驗組用藥對大鼠的生存狀況沒有明顯影響.

圖1 大鼠體質量的變化情況Fig.1 Changes in body mass of rats

3.2 柏苓顆粒對給藥前后血清尿酸濃度的影響

各組大鼠給藥前、后血清SUA濃度,如表1所示.表1中：n為大鼠數量;c0(SUA)為給藥前SUA濃度;c1(SUA)為給藥后SUA濃度.

表1 各組大鼠的給藥前、后血清SUA濃度Tab.1 Concentration of SUA in serum of each group of rats before and after administration

由表1可知：經氧嗪酸鉀灌胃造模的其他組大鼠血清尿酸極顯著高于空白組大鼠,說明HUA模型建立成功;模型組大鼠血清SUA濃度極顯著高于空白組大鼠,說明結果有意義,具有參考價值;非布司他組大鼠及柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的給藥后SUA濃度極顯著低于模型大鼠,柏苓湯劑組大鼠與柏苓顆粒低劑量組大鼠的給藥后SUA濃度顯著低于模型組大鼠,柏苓顆粒劑組大鼠的給藥后SUA濃度呈劑量性降低趨勢,說明柏苓顆粒與柏苓湯劑都具有顯著的降尿酸效果,且高、中劑量柏苓顆粒的降尿酸效果比柏苓湯劑更顯著,與非布司他相當.

3.3 柏苓顆粒對血清XOD和ADA活性的影響

各組大鼠的給藥后血清XOD與ADA活性,如表2所示.表2中：zs(XOD)/nkat·L-1為給藥后血清XOD活性;zs(ADA)/nkat·L-1為給藥后血清ADA活性.

表2 各組大鼠的給藥后血清XOD與ADA活性Tab.2 Activity of XOD and ADA in serum of each group of rats after administration

由表2可知：模型組大鼠的血清XOD和ADA活性極顯著高于空白組大鼠,非布司他組大鼠的血清XOD活性的影響對比模型組大鼠極顯著下降,而對血清ADA無明顯影響;柏苓湯劑組、柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的血清XOD,ADA活性對比模型組大鼠極顯著下降,柏苓顆粒低劑量組大鼠的血清XOD,ADA活性顯著下降,說明柏苓顆粒能顯著抑制血清XOD和ADA活性.

3.4 柏苓顆粒對肝臟XOD,ADA和HGPRT活性的影響

各組大鼠的給藥后肝臟XOD, ADA與HGPRT活性,如表3所示.表3中：zl(XOD)為給藥后肝臟XOD活性;zl(ADA)給藥后肝臟ADA活性;zl(HGPRT)為給藥后肝臟HGPRT活性.

表3 各組大鼠的給藥后肝臟XOD, ADA與HGPRT活性Tab.3 Liver XOD, ADA, and HGPRT activity in each group of rats after administration

由表3可知：模型組大鼠的肝臟XOD和ADA活性極顯著高于空白組大鼠,其中,非布司他組、柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的肝臟XOD活性對比模型組大鼠極顯著下降,柏苓顆粒低劑量組大鼠的肝臟XOD活性顯著下降;除非布司他組大鼠外,其他給藥組大鼠的肝臟ADA活性均極顯著低于模型組大鼠;模型組大鼠的肝臟HGPRT活性較空白組大鼠有下降趨勢,但無統計學意義,柏苓顆粒組大鼠的肝臟HGPRT活性有呈劑量上升趨勢,但與模型組大鼠相比,無統計學意義,說明柏苓顆粒能顯著降低XOD與ADA活性,對HGPRT活性無明顯影響.因此,柏苓顆粒對嘌呤代謝酶具有選擇性,而XOD與ADA是其主要作用靶點,降尿酸作用也與XOD,ADA作用靶點有一定相關性.

3.5 柏苓顆粒對BUN和Cr濃度的影響

BUN和Cr是評估腎功能的兩個指標,能反映腎小球的濾過率,當腎小球濾過功能損壞,腎功能降低時,血清BUN和Cr濃度會異常升高.各組大鼠的血清BUN和Cr濃度,如圖2所示.圖2中：c(BUN)為BUN濃度;c(Cr)為Cr濃度.由圖2可知：各組大鼠的血清BUN和Cr的濃度差異無統計學意義,說明氧嗪酸鉀造模方法不會損害大鼠腎臟,以及柏苓顆粒與柏苓湯劑對HUA 大鼠無腎損傷,安全性良好.

(a) BUN (b) Cr圖2 各組大鼠的血清BUN和Cr濃度Fig.2 Concentrations of BUN and Cr in serum of each group of rats

3.6 柏苓顆粒對OAT1 和URAT1蛋白相對表達水平的影響

OAT1和URAT1蛋白免疫印跡條帶圖,如圖3所示.各組大鼠的腎臟OAT1與URAT1蛋白相對表達水平,如圖4所示.由圖4可知：高劑量柏苓顆粒與非布司他、柏苓湯劑對比模型組能極顯著上調腎臟OAT1蛋白相對表達水平,中劑量柏苓顆粒能顯著上調OAT1蛋白相對表達水平,低劑量柏苓顆粒對OAT1蛋白相對表達水平的影響不顯著;對比模型組,高、中劑量柏苓顆粒與柏苓湯劑均有極顯著抑制效果,非布司他與低劑量柏苓顆粒對URAT1相對表達水平均無統計學意義.因此,高劑量柏苓顆粒對OAT1和URAT1蛋白相對表達水平的影響與柏苓湯劑相當,其促進尿酸排泄機制可能與促進尿酸的分泌與重吸收的OAT1及URAT1蛋白有關.

圖3 OAT1和URAT1蛋白免疫印跡條帶圖Fig.3 Western blot band diagram of OAT1 and URAT1 proteins

(a) OAT1 (b) URAT1圖4 各組大鼠的腎臟OAT1與URAT1蛋白相對表達水平Fig.4 Relative expression levels of proteins of OAT1 and URAT1 in kidneys of each group of rats

4 結論

氧嗪酸鉀作為尿酸酶的競爭性抑制劑,它能結合大鼠體內的尿酸酶并顯著降低尿酸酶活性,從而阻礙尿酸分解.采用灌胃氧嗪酸鉀持續10 d,建立HUA模型,效果顯著.但由于后續14 d的給藥期間停止造模,除空白組外其他組大鼠血尿酸都有所下降,說明結果有意義,具有參考價值.

肝臟是嘌呤合成及回收的主要部位,嘌呤堿基在肝臟中可直接合成產生尿酸的原料(嘌呤核苷酸).催化嘌呤分解代謝的酶主要分為抑制尿酸合成酶與促進尿酸合成酶兩類,HGPRT是肝臟中一種抑制尿酸的生成的主要代謝酶,能促進鳥嘌呤與次黃嘌呤回收,防止嘌呤堿潴留[5].HGPRT參與嘌呤回收過程并控制尿酸的合成,HGPRT質量分數升高,可增加嘌呤堿回收量,進而減少尿酸合成的機會,相反地,HGPRT質量分數減少,嘌呤堿回收減少,尿酸合成的原料增多,血尿酸水平亦隨之升高.ADA和XOD是嘌呤代謝過程中促尿酸合成的關鍵酶,分別限制著腺嘌呤與黃嘌呤形成尿酸的速率,其活性越高,尿酸合成水平隨之升高.HGPRT,ADA與XOD的活性相對反應了鳥嘌呤、腺嘌呤與次黃嘌呤代謝生成尿酸的情況.柏苓顆粒對肝臟HGPRT濃度無顯著影響,而抑制了ADA這一合成尿酸前產物次黃嘌呤核苷的關鍵酶活性,以及抑制了生成尿酸的XOD的活性,說明柏苓顆粒降尿酸的靶點可能與抑制XOD與ADA活性有關,而與HGPRT無關.

除了抑制尿酸生成的關鍵酶外,增加尿酸的排泄量是另一降尿酸的途徑.大部分尿酸鹽的排泄需經過腎小管上皮的尿酸重吸收與排泄轉運蛋白[6].OAT1蛋白是腎臟中一個與尿酸分泌密切相關的蛋白[7],其相對表達水平增加可促使體內尿酸排出體外,而達到降低尿酸的作用.URAT1蛋白位于腎臟近曲小管,是介導大部分尿酸重吸收的蛋白,也是目前研究較為廣泛的尿酸排泄蛋白[8].實驗主要研究了柏苓顆粒對大鼠腎臟中控制尿酸鹽重吸收及排泄的URAT1與OAT1蛋白的影響.在中醫的理論中,濕熱是痛風發作的致病因素,而清利濕熱的方劑是用藥首選,其中,利水祛濕的中藥能顯著增加尿酸排泄的效果[2],柏苓顆粒中的土茯苓、薏苡仁都有利水滲濕的功效,能促進尿酸經腎臟排泄,且對腎臟有一定保護作用[9-12].因此,柏苓顆粒降尿酸效果良好,無明顯毒副作用,其作用機制與抑制ADA與XOD的活性及減少URAT1蛋白相對表達水平、增加OAT1蛋白相對表達水平相關.