基于ITGB4/FAK/p38信號通路蒙藥藍盆花總黃酮提取物體內外抗肝纖維化的作用研究

趙曉璐 孟根斯立木 張春艷 顏羽昕 高曉陽 馬月宏

全球每年因肝病死亡的人數高達200萬人[1]。肝纖維化是由各類肝病所導致的關鍵階段,是機體應對各類肝損傷調控異常時發生的病理過程,其主要是由于肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)在肝損傷的情況下被活化為肌成纖維細胞,進而導致細胞外基質的大量沉積,促使α-SMA、collagenⅠ和collagenⅢ增加,導致肝纖維化的發生、發展[2～5]。而目前業內專家對新藥的研發具有很高的期望,但很多抗肝纖維化藥物研發進展緩慢,目前尚無藥物獲得批準,因此開發一種有效治療肝纖維化的藥物刻不容緩。

蒙藥藍盆花又稱蒙古山蘿卜花,主產于內蒙古自治區、黑龍江省、吉林省等地,窄葉藍盆花和華北藍盆花目前在內蒙古自治區被廣泛研究[6～8]。該藥具有甘、澀、鈍、燥、膩、重、涼等性味,清熱、“燥協日烏素”之功能[9]。筆者所在課題組前期經UHPLC-TOF-MS/MS鑒定藍盆花中含有氨基酸、酚類、皂苷、黃酮、生物堿等有效成分,起主要作用的為黃酮類物質,已有文獻表明,在蒙藥經典方劑德都紅花-7、額力根-7中的黃酮類成分具有顯著的抗纖維化作用[10]。此外,有研究表明,整合素β4(integrin β4,ITGB4)是一種跨膜受體,參與腫瘤的發生和侵襲,ITGB4在肝癌細胞中主要促進細胞增殖、侵襲、集落形成,并誘導上皮間質軸化,同時促進collagenⅠ的增殖,并通過與表皮生長因子受體相互作用觸發FAK-Akt通路,促進肝癌的發展[11,12]。

圖1 肝組織HE染色病理改變(×200)A.空白組; B.模型組; C.TFS低劑量組; D.TFS中劑量組; E.TFS高劑量組

圖2 肝組織Masson染色病理改變(×200)A.空白組; B.模型組; C.TFS低劑量組; D.TFS中劑量組; E.TFS高劑量組

p38/MAPK信號通路是調控細胞凋亡和炎性細胞因子的重要通路。符健等[13]研究表明,和厚樸酚通過p38/MAPK/Nrf2信號通路控制肝纖維化的發展,故經轉錄組測序及生物信息學分析并相關文獻考證發現ITGB4/非受體酪氨酸激酶(focal adhesion kinase,FAK)/p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK,p38亞型)通路與細胞凋亡、炎性反應相關,通過調節相關因子進而可能參與肝纖維化的發生、發展[14,15]。本研究旨在通過體內和體外實驗來驗證藍盆花總黃酮(total flavonoid extract of Scabiosa comosa,TFS)抗肝纖維化作用及可能機制,為臨床提供一定的實驗依據。

材料與方法

1.實驗材料與試劑:藍盆花購自內蒙古天盛蒙中醫有限責任公司,TFS自制;50只Wistar雄性大鼠,7周,體質量為180～200g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,批號:SCXK(京)2016-0006。HSC-T6細胞購自北京北納創聯生物技術研究院。ALT、AST、ALP、羥脯氨酸檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;MTT檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司;α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38抗體均購自武漢三鷹生物技術有限公司;凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、FAK、p38引物購自上海生工生物工程有限公司。臺式高速離心機(CT15RE)購自日本日立公司;SM2010R型切片機購自德國Leica公司;酶標儀(CLx800) 購自美國Biotek儀器有限公司;DYY-6C型電泳儀購自北京六一生物科技有限公司;7500 Fast型熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)儀購自美國Thermo Fisher Scientific科技公司;BX51型顯微鏡購自日本Olympus 有限公司;FACS Aria流式細胞儀購自美國BD公司。

2.動物分組及處理:所有大鼠均在相對溫濕度且光照良好的條件下喂養,隨機分為空白組,模型組,TFS高、中、低劑量(200mg/kg、100mg/kg、50mg/kg)組,每組10只給藥;給藥劑量參照《人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表》計算得出上述劑量。除空白組、模型組和TFS各劑量組用2ml/kg的50% CCl4-花生油溶液灌胃,2次/周,持續10周,在造模期間,空白組和模型組均采用0.5%CMC-Na灌胃,高、中、低劑量組按上述劑量灌胃,10周后進行腹主動脈取血及肝組織,用于后續實驗研究。

3.細胞培養:于-80℃冰箱取HSC-T6細胞在37℃水浴鍋中復蘇1min后接種于培養瓶中,加完全培養基于培養瓶中,在5% CO2培養箱中培養至貼壁,隔天換液及傳代,收集對數生長期細胞進行后續實驗。

4.TFS提取:稱取1kg蒙藥藍盆花,以1∶10的藥液比配制成溶液后,采用乙醇回流方法,即在10000ml 70%乙醇中回流提取2h,以此重復兩次,接著過濾、旋轉蒸發儀濃縮、干燥,進而獲取TFS粉末。課題組前期已測得其總黃酮含量,即以蘆丁為對照品溶液,將上述所獲得的粉末經過篩、乙醇回流等操作制得供試品溶液,用紫外可見光分光度計在509nm波長下測定吸光度繪制標準曲線,從而測得總黃酮含量[16]。

5.肝組織血清水平及病理學檢測:末次給藥后,經腹主動脈取血,分離血清,按照試劑盒說明書檢測血清中丙氨酸氨基轉移酶(glutamic-pyruvic transaminase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(glutamic-oxaloacetic transaminase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)以及肝組織中羥脯氨酸(hydroxyproline, HYP)含量。同時將肝組織在多聚甲醛溶液中固定24h,脫水、石蠟包埋、切片脫蠟、進行蘇木精-伊紅(hematoxylin eosin, HE)和Masson染色, 在鏡下觀察染色結果。

6.差異表達基因:通過運用轉錄組測序技術從整體上檢測空白組、模型組、TFS劑量組之間的基因表達水平變化情況。

7.差異基因的GO和KEGG富集:對差異基因進行GO和KEGG富集分析,篩選出與肝纖維化關系密切的ITGB/FAK/p38信號通路和靶點,并進行實驗驗證。

8.MTT檢測HSC-T6細胞生長抑制率:將處于對數生長期細胞用胰蛋白酶消化3min至脫落,再加入等量完全培養基終止消化,收集細胞懸液,按密度5×103/ml接種于96孔板,每組5個復孔,待其貼壁后給予不同濃度TFS(5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml、80μg/ml)干預,在培養箱中分別培養24、48和72h后向每個孔中避光添加10μl MTT溶液,接著連續培養4h,棄上清液后向每個孔中添加110μl Formazan,置于搖床勻搖10min,最后在酶標儀490nm波長測得吸光度值并記錄。計算抑制率,進而確定后續給藥高、中、低濃度(37.5μg/ml、25.0μg/ml、12.5μg/ml)。

9.q-PCR法檢測:肝組織需在研缽中進行研磨充分后進行裂解,而HSC-T6細胞可直接在板中加裂解液,按照常規Trizol法提取肝臟和HSC-T6細胞總RNA,待其純度與濃度經檢測符合后,進行反轉錄為cDNA,在CFX96熒光定量RT-PCR儀器上擴增cDNA。擴增程序在95℃處進行變性,持續10min,95℃處復性15s,在60℃處延長1min,以β-actin為內參對照,結果采用2-△△Ct法進行相對定量分析。其引物序列有,ITGB4上游引物:5′-AGCGGAAGAGGTGGTGGAGTAC-3′,下游引物:5′-GAGCAACAGGAGGAAGATGAGCAG-3′;FAK上游引物:5′-AGCAACTTGTCCAGCATCAGCAG-3′,下游引物:5′-GGATCGGTCAAGGTTGGCAGTG-3′;p38上游引物:5′-AGGAGAGGCCCACGTTCTAC-3′,下游引物:5′-CCGGGGACAGGTTCTGGTAT-3′;collagen Ⅰ上游引物:5′-TGTTGGTCCTGCTGGCAAGAATG-3′,下游引物:5′-GTCACCTTGTTCGCCTGTCGCAGC-3′;α-SMA上游引物:5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTGACTAC-3′,下游引物:5′-CCATCAGGCAGTTCGTAGCTCTTC-3′;β-actin上游引物:5′-ACCCGCGAGTACAACCTTCT-3′,下游引物:5′-TTCAGGGTCAGGATGCCTCT-3′。

10.Western blot法檢測:取肝組織和HSC-T6細胞加入PMSF和RIPA經細胞破碎儀充分裂解,4℃下12000r/min離心10min,取上清液加入5×蛋白上樣緩沖液,100℃煮沸10min,室溫冷卻后于-80℃冰箱中保存。制備濃縮膠和分離膠,進行條件為恒壓80V下電泳,恒流200mA條件下轉膜,5%脫脂奶粉室溫封閉3h,用α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38一抗孵育4℃過夜,次日TBST洗滌3次,室溫孵育IgG二抗1h,TBST洗滌3次,每次10min。進行掃膜操作,并采用ImageJ測定條帶灰度值,進而進行蛋白表達量的統計分析。

11.Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測HSC-T6細胞的凋亡率:接種對數生長期細胞于6孔板,隨即分成空白組,TFS高、中、低劑量組,每組4個復孔,干預HSC-T6細胞,待其貼壁后培養24h,再加入相應濃度的TFS(37.5μg/ml、25.0μg/ml、12.5μg/ml)連續培養24h,12000r/min離心5min,棄上清,加入390μl Annexin V-FITC結合液重懸細胞,加入5μl Annexin V-FITC和PI混勻。孵育20min后上機檢測各組的凋亡率。

結 果

1.血清學檢測:與空白組比較,模型組ALT、AST、ALP顯著增高(P<0.01);與模型組比較,TFS各劑量組 ALT、AST、ALP顯著下降(P<0.01)。HYP結果提示,與空白組比較,模型組大鼠HYP含量顯著增高(P<0.01);與模型組比較,TFS各組含量顯著下降(P<0.05,表1)。

表1 ALT、AST、ALP、HYP測定結果

2.組織病理檢測:正常肝臟的核大而圓,肝細胞排列均勻且無脂肪變性、無纖維組織增生;模型組實質細胞減少,肝細胞外間質過度沉積,肝細胞排列不齊并伴有大量炎性細胞;與模型組比較,TFS可以使結締組織增殖減少,炎性細胞浸潤程度減緩,顯著降低了纖維化程度(圖1,圖2)。

3.差異表達基因:轉錄組測序差異轉錄本和基因的整體分布圖所示,篩選閾值默認設置為q<0.05。TFS各劑量組和模型組比較,上調的mRNA有58個,下調的有81個,詳見圖3。

圖3 差異基因火山圖

4.差異基因的GO和KEGG富集:通過GO和KEGG富集分析,發現有多條信號通路與肝纖維化相關性顯著,最后根據 rich factor、q相關參數的密切程度,選擇ITGB/FAK/p38信號通路加以驗證,詳見圖4。

圖4 KEGG富集熱圖

5.TFS對肝組織α-SMA、collagenⅠ、FAK、ITGB4、p38mRNA相對表達量的影響:模型組α-SMA、collagenⅠ、FAK、ITGB4及p38mRNA相對表達量與空白組比較顯著增高(P<0.05);TFS劑量組中α-SMA、collagenⅠ、FAK、ITGB4、p38mRNA相對表達量與模型組比較顯著下降(P<0.05),詳見圖5。

圖5 TFS對肝組織中α-SMA、collagenⅠ、FAK、ITGB4、p38 mRNA相對表達量的影響A.α-SMA;B. collagenⅠ;C.FAK;D.ITGB4;E.p38與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01

6.TFS對肝組織α-SMA、collagen Ⅰ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38的蛋白表達量的影響:模型組α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38蛋白表達量與空白組比較顯著增高(P<0.05);TFS劑量組中α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38蛋白表達量與模型組比較顯著下降(P<0.05),詳見圖6。

圖6 TFS對肝組織中α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38的蛋白表達量的影響A、B.Western blot電泳圖;C.α-SMA;D.collagenⅠ;E.ITGB4;F.p-FAK;G.p38;H.p-p38與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與空白組比較,#P<0.05,##P<0.01

7.TFS抑制了HSC-T6細胞增殖:MTT結果詳見圖7,與空白組比較,TFS高、中、低劑量組均對HSC-T6細胞有不同程度的抑制作用,抑制率分別為68.8%、41.2%、36.1%,差異有統計學意義(P<0.05)。

圖7 TFS對HSC-T6細胞增殖的影響

8.TFS對HSC-T6細胞凋亡的影響:流式細胞儀結果詳見圖8,與空白組比較,TFS高、中、低劑量組對HSC-T6細胞有顯著的促進凋亡作用(P<0.01),且更傾向于晚期凋亡。

圖8 TFS對HSC-T6細胞凋亡的影響

9.TFS對HSC-T6細胞中FAK、ITGB4、p38mRNA相對表達量的影響:和空白組比較,TFS高、中、低劑量組中FAK、ITGB4、p38mRNA相對表達量顯著降低(P<0.05),詳見圖9。

圖9 TFS對HSC-T6細胞中FAK、ITGB4、p38mRNA表達量的影響A.FAK;B.ITGB4;C.p38。與空白組比較,*P<0.05;**P<0.01

10.TFS對HSC-T6細胞中ITGB4、p-FAK、p38、p-p38蛋白表達的影響:與空白組比較,TFS高、中、低劑量組中ITGB4、p-FAK、p38、p-p38蛋白表達量顯著降低(P<0.05),詳見圖10。

圖10 TFS對HSC-T6細胞中ITGB4、p-FAK、p38、p-p38蛋白表達量的影響A.Western blot電泳圖;B.ITGB4;C.p-FAK;D.p38;E.p-p38。與空白組比較,*P<0.05;**P<0.01

討 論

肝纖維化以各種病因導致的肝臟損傷為基礎,促使多種細胞因子的釋放作用于HSC,使其活化并轉化,繼而ECM生成與降解失衡,肝組織逐漸進展為瘢痕性組織的一種過程[17]。因此。探索抗肝纖維化藥物的作用機制,對治療肝纖維化具有重要意義。蒙藥藍盆花中的黃酮成分具有解熱、抗氧化、抗炎作用[18,19]。

本研究證實藍盆花總黃酮提取物對CCL4誘導的大鼠肝纖維化具有顯著的保護作用。通過對體內動物的血清生化檢測、病理組織檢測等發現,不同劑量TFS不僅可以降低ALT、AST、ALP、HYP的表達水平,而且可以明顯改善大鼠肝臟炎性細胞的浸潤,促使纖維化增生減少,顯著改善組織病理學改變,并顯著降低α-SMA、collagenⅠ的表達量。經轉錄組測序分析,證實了肝纖維化經藍盆花總黃酮提取物治療后基因譜發生的變化,通過對差異基因進行GO和KEGG分析以及查閱文獻發現,ITGB4/FAK/p38信號通路可能參與肝纖維化過程,驗證了 ITGB4/FAK/p38 通路有關的 mRNA及蛋白表達量,發現經TFS 干預后該通路呈下調狀態,而本研究同時也從細胞水平證明藍盆花總黃酮提取物明顯抑制HSC-T6細胞的增殖及活化,在mRNA和蛋白水平上顯著抑制α-SMA、collagenⅠ、ITGB4、p-FAK、p38、p-p38的表達,此結果與體內實驗所得結果一致,因此可以進一步明確藍盆花總黃酮提取物具有抑制大鼠HSC活化,抑制膠原沉積的作用;且對HSC-T6細胞凋亡具有促進作用,且更傾向于促進晚期凋亡。

綜上所述,結合轉錄組測序結果并基于以上實驗結果,證實蒙藥藍盆花總黃酮提取物可以通過抑制HSC活化、增殖、促進其凋亡從而起到抗肝纖維化作用。其作用機制可能和抑制ITGB4/FAK/p38信號通路有關,表明蒙藥藍盆花總黃酮對肝纖維化有潛在的治療作用。