心肌成纖維細胞DDR2對整合素β1調控的機制研究

郝春媛 李同華 李 霞 葛興利 張譽洋

心肌纖維化是眾多心血管疾病,如冠心病、心肌梗死、風濕性心臟病、高血壓等發展至后期的共同病理改變,是影響心血管疾病預后和心血管疾病病死率的重要原因[1,2]。心肌成纖維細胞是心肌纖維化發生的關鍵效應器,其在心肌損傷后的心肌改建和心室重塑中起著重要作用[3]。心肌成纖維細胞的表型在心臟發生損傷后發生代償性改變,從心臟內的結構支持型細胞轉變為可以分泌大量生長因子和細胞基質的分泌型細胞,同時其增殖能力明顯強化,在增殖過程中,分泌大量的Ⅰ型和Ⅲ型膠原促進損傷心肌組織進行改建從而形成疤痕修復損害心肌并促進心室重塑[4～6]。表型轉變的心肌成纖維細胞在急性心肌損傷的急性修復期度過以后,仍然駐留于損傷部位,繼續分泌膠原和生長因子,導致心肌局部的膠原過度蓄積以及繼發性纖維化,這種結構性變化可以導致心肌舒縮功能的顯著性降低[7]。目前所發現的,對于調控心肌成纖維細胞分泌膠原的重要內分泌因子即是血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ)[8]。

成纖維細胞不但自身分泌膠原,也通過相應的膠原受體和間質中的膠原相互作用,從而繼發調控成纖維細胞的功能。目前發現的膠原受體包括整合素(integrin),盤狀結構域受體(discoid domain receptors,DDRs)、糖蛋白Ⅵ以及白細胞相關免疫球蛋白受體-1[9,10]。這些膠原受體可以接受機械和生物化學信號,通過啟動一系列信號轉導機制從而調控細胞的黏附、增殖、分化和遷移,同時也維持著基質的穩態。在眾多類型膠原受體中,DDRs屬于跨膜的酪氨酸激酶受體超家族,其胞外域含有典型的盤狀結構模序。目前已經鑒別的共有兩類DDRs,包括DDR1和 DDR2。研究表明,DDRs在和膠原結合以后,參與到多種疾病的發生和發展中,包括動脈粥樣硬化、炎癥、腫瘤以及纖維化過程中[10～14]。DDR2是心肌成纖維細胞表達的主要膠原受體,除此之外心肌成纖維細胞也表達另外一種膠原受體整合素β1[15]。整合素屬于跨膜受體家族,是由α和β亞單位組成的二聚體,正常心肌組織中主要表達含β1亞單位的整合素,作為細胞受體介導成纖維細胞和基質間的交流。研究發現,酪氨酸激酶受體和整合素之間存在著協同作用并促進動脈粥樣硬化、腫瘤轉移以及血管生成,但在心肌成纖維細胞中,DDR2和整合素β1兩種受體之間的相互影響效應目前并無相關報道[16]。本研究旨在考察DDR2對于整合素β1的調控作用及其機制。

材料與方法

1.材料:Ang Ⅱ、NaHCO3和HEPES購自美國Sigma-Aldrich公司,DDR2 的小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)、轉化生長因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)siRNA、對照siRNA、Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。大鼠DDR2高表達載體和G418購自北京Sino Biologicals科技有限公司。質粒小提和大提試劑盒購自美國Promega公司。Opti-MEM培養基和胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)購自美國Gibco公司。DDR2、TGF-β1、細胞外調節蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,Erk1/2)抗體以及PD98059購自美國Cell Signaling Technology公司。整合素β1、Myc和β-actin抗體購自英國Abcam公司。成年雄性Sprague-Dawley大鼠(8～12周)由西安交通大學醫學部實驗動物中心提供,實驗動物使用許可證號:SYXK (陜)2020-005,動物的飼養和處死均遵循西安交通大學醫學部倫理學委員會制定的基本動物實驗倫理原則進行。

2.心肌成纖維細胞的分離和鑒定:大鼠開胸取心臟,取左心室游離壁組織剪碎,冷PBS清洗4次,加入含0.1%胰酶和0.1%膠原酶的消化液中于37℃搖床振搖(100r/min)消化10min后,吸取收集消化后所得的細胞懸液,再加入新的消化液,重復8次。收集所有細胞懸液,400×g離心5min,加入PBS清洗后再次離心,加入10ml培養基重懸細胞,用70μm細胞濾器過濾后接種至細胞培養皿,在細胞培養箱中差速分離1h,更換Opti-MEM培養基繼續培養,培養液含有10% FBS、20mmol/L NaHCO3、5mmol/L HEPES 以及1%青-鏈霉素,80%融合時傳代,取P3代細胞進行鑒定及后續實驗。心肌成纖維細胞的鑒定使用免疫組化染色,Ⅷ因子相關抗原染色陰性同時波形蛋白染色陽性。

3.siRNA以及高表達DDR2質粒的轉染:siRNA轉染步驟嚴格按照Lipofectamine RNAiMAX和Lipofectamine2000 的說明書進行操作,具體步驟:稀釋9μl Lipofectamine RNAiMAX到150μl Opti-MEM培養液中,另稀釋3μl濃度為10μmol/L濃度的siRNA到150μl Opti-MEM培養液中,然后混合兩種稀釋液室溫放置5min,加入到30mm培養皿里已經80%融合的心肌成纖維細胞培養液中,轉染24h后更換新鮮培養液,48h以后收集細胞驗證干擾效應。DDR2高表達質粒轉染操作步驟與上述步驟類似,心肌成纖維細胞接種于30mm培養皿中,待80%融合后,分別加入2μg DDR2高表達質粒和空載質粒以及Lipofectamine 2000,轉染后6h更換新鮮培養液,然后繼續培養24h后用800mg/L G418 篩選高表達DDR2的細胞克隆。

4.免疫印跡:細胞在裂解液(50mmol/L Tris,100mmol/L NaCl,5mmol/L EDTA,1mmol/L EGTA,5mmol/L MgCl2,1% Triton X-100,1%甘油以及1 ×的蛋白酶抑制劑) 中置于冰上裂解1h,15000×g,4℃離心15min,收集上清蛋白液。蛋白液測量濃度后,取40μg 蛋白使用SDS-PAGE 分離,然后把蛋白轉移到PVDF 膜上。其后使用5%的脫脂牛奶封閉1h 后,與含有第Ⅰ抗體的5%脫脂牛奶在4℃孵育過夜,PBST 清洗后,再與HRP偶聯的第Ⅱ抗體孵育1h。此后加入反應發光液進行信號采集(Immobilon Western Chemiluminescent HRP 底物系統,美國Millipore公司)。實驗均重復3次,圖像用ImageJ軟件進行灰度分析。

結 果

1．AngⅡ通過DDR2調控整合素β1:原代培養的心肌成纖維細胞貼壁生長,呈梭形或狹長的多邊形(圖1A),筆者選取第3代細胞進行后續實驗。心肌損傷時存在著AngⅡ在心肌內表達和分泌上調,AngⅡ繼而刺激心肌成纖維細胞表型的轉變,分泌大量膠原并促進心肌纖維化[17,18]。鑒于整合素β1 在心肌梗死后和壓力超負荷中表達量均上調并促進了膠原的分泌和纖維化,首先檢測了AngⅡ是否可以影響心肌成纖維細胞整合素β1的表達[19,20]。為了確認AngⅡ調控整合素β1的最佳濃度和時間,筆者分別進行了AngⅡ的濃度梯度和時間梯度實驗,濃度梯度分別選擇了0.1、0.5和1.0μmol/L,Western blot法實驗顯示1.0μmol/L能夠獲得整合素β1最顯著的增強效果。時間梯度筆者選擇了6、12和24h,結果發現1.0μmol/L AngⅡ作用12h后整合素β1的表達達到峰值。因此,本實驗選擇1.0μmol/L AngⅡ作用于細胞12h作為標準刺激因素。結果表明,AngⅡ可以顯著性上調心肌成纖維細胞整合素β1的表達(圖1中B、D),同時,AngⅡ也可以上調心肌成纖維細胞DDR2的表達(圖1D)。為了考察DDR2的表達上調是否介導了AngⅡ增強整合素β1的效應,筆者使用DDR2的siRNA沉默DDR2的表達,實驗發現,相比對照性小干擾RNA(control small interference RNA,siCTRL),DDR2siRNA可以顯著性降低心肌成纖維細胞DDR2的表達(圖1C)。在DDR2基因沉默后心肌成纖維細胞繼續接受AngⅡ刺激12h,AngⅡ上調整合素β1的效應被完全阻斷(圖1中D、E,P<0.05)。本研究結果表明,AngⅡ增強整合素β1的效應是通過上調DDR2而介導。

圖1 AngⅡ通過DDR2調控整合素β1A.原代分離的心肌成纖維細胞(×200);B.AngⅡ對心肌成纖維細胞整合素β1表達的影響;C.心肌成纖維細胞中DDR2的RNA干擾;D.心肌成纖維細胞在DDR2干擾的前提下,AngⅡ對整合素β1表達的影響;E. DDR2干擾后WB圖像的定量分析。siCTRL:Control siRNA; siDDR2:DDR2siRNA

2.AngⅡ通過DDR2-Erk1/2途徑調控整合素β1:實驗發現磷酸化的Erk1/2在AngⅡ刺激細胞后顯著性上調(圖2A),而DDR2的RNAi可以顯著性抑制AngⅡ引起的磷酸化Erk1/2的升高效應(圖2中A、B,P<0.05),說明AngⅡ-DDR2的信號可以影響下游的細胞內Erk1/2通路。前面的實驗已經證實了AngⅡ-DDR2通路可以調控整合素β1的表達水平,為了考察Erk1/2是否在AngⅡ-DDR2調控整合素β1的過程中起介導作用,使用能夠完全抑制Erk1/2磷酸化的特異性抑制劑PD98059阻斷了Erk1/2分子的信號傳遞功能,在此基礎上用AngⅡ刺激心肌成纖維細胞,結果發現PD98059在完全抑制了Erk1/2磷酸化效應后,也顯著性抑制了AngⅡ上調整合素β1的效應(圖2中C、D,P<0.05)。實驗結果表明了AngⅡ-DDR2信號是通過Erk1/2的傳遞從而調控心肌成纖維細胞整合素β1的表達水平。

圖2 AngⅡ通過DDR2-Erk1/2-TGF-β1途徑調控整合素β1A.心肌成纖維細胞在DDR2干擾以后,接受AngⅡ刺激;B.DDR2干擾后Western blot法圖像的定量分析和統計;C.心肌成纖維細胞在使用PD98059 處理1h后,接受AngⅡ刺激;D.使用PD98059處理后WB圖像的定量分析和統計;E.心肌成纖維細胞在TGF-β1干擾以后,接受AngⅡ刺激;F.TGF-β1干擾以后Western blot法圖像的定量分析和統計。Ctrl siR:Control siRNA;DDR siR:DDR2siRNA;TGF-β1siR:TGF-β1siRNA

3.AngⅡ通過DDR2-Erk1/2-TGF-β1途徑調控整合素β1:多項研究發現TGF-β1在心肌纖維化的過程中起著重要作用[21,22]。本研究均發現AngⅡ刺激細胞后引起TGF-β1顯著升高(圖2A),DDR2的siRNA可以抑制AngⅡ引起的TGF-β1的升高(圖2中A、B,P<0.05)。當筆者使用Erk1/2的抑制劑時,在削弱AngⅡ-DDR2引起整合素β1的升高效應時,同時還發現TGF-β1的升高效應也被顯著性地抑制了(圖2中C、D,P<0.05),提示TGF-β1受到AngⅡ-DDR2-Erk1/2信號通路調控。為了探究TGF-β1是否也在AngⅡ-DDR2-Erk1/2調控整合素β1中起著重要作用,筆者使用TGF-β1的RNA干擾沉默了TGF-β1的表達,在此基礎上使用AngⅡ刺激心肌成纖維細胞,結果發現TGF-β1的降低顯著削弱了AngⅡ-DDR2-Erk1/2信號對于整合素β1的上調效應(圖2中E、F,P<0.05)。TGF-β1參與了AngⅡ對于心肌成纖維細胞整合素β1表達的調控。

4.DDR2的高表達通過TGF-β1上調整合素β1:為了進一步驗證DDR2的RNA干擾實驗,筆者上調了DDR2的表達以觀察其對整合素β1的影響。實驗使用了攜帶Myc標簽的DDR2高表達載體轉染心肌成纖維細胞從而直接上調DDR2的蛋白表達量。與RNA干擾實驗結果一致,DDR2的高表達可以顯著升高TGF-β1和整合素β1的蛋白表達水平(圖3A),同時也升高了p-Erk1/2的水平。當使用TGF-β1的RNA干擾沉默了TGF-β1的表達后,TGF-β1的降低顯著削弱了高表達DDR2對于整合素β1的上調效應(圖3中B、C,P<0.05)。使用PD98059處理細胞也部分削弱了高表達DDR2對于整合素β1的刺激效應。

圖3 高表達DDR2通過TGF-β1顯著增加整合素β1的表達A.心肌成纖維細胞高表達攜帶Myc標簽的DDR2;B.高表達DDR2的細胞進行TGF-β1的RNA干擾;C.TGF-β1的RNA干擾后的Western blot法圖像分析和統計。DDR2 OE.DDR2過表達;Ctrl siR.Control siRNA;TGF-β1siR.TGF-β1siRNA

討 論

盡管心力衰竭的預防和治療已經取得了很大進展,但是心力衰竭還是維持著較高的發生率和病死率[23]。持續的心臟內成纖維細胞的活化以及繼發的間質纖維化促進了心力衰竭的發展[3,24]?；诖?抑制心肌纖維化是阻止心力衰竭的發展的重要措施[25]。目前臨床上多使用血管緊張素轉換酶抑制劑或AngⅡ受體阻斷劑如新型藥物沙庫巴曲纈沙坦,對抗AngⅡ誘發的心肌纖維化和心室重塑,盡管如此,關于血管緊張素Ⅱ促進心肌纖維化的具體分子機制,目前還存在很多未知的問題沒有解決。

心肌成纖維細胞分泌的大量膠原除了作為結構性改建的基本成份外,膠原和成纖維細胞之間相互作用的分子機制一直都是值得深入研究的問題。在心肌損傷后繼發的纖維化過程中,大量的膠原纖維包繞著成纖維細胞,膠原纖維和成纖維細胞表面的膠原受體相互作用,調控著成纖維細胞的生物學特性,包括其增殖、移行和分泌等多種生物功能,尤其是成纖維細胞分泌膠原的能力對于整個心肌損傷后的改建和重塑起著非常重要的作用。目前發現的主要介導成纖維細胞和膠原相互作用的受體為DDR和黏附分子整合素β1。黏附分子從來就不是單純介導細胞間的黏附,多種黏附分子的胞內段和信號蛋白相偶聯,調控著信號從細胞外向細胞內的傳遞,影響著細胞的多種生理功能。整合素β1本身通過和黏附分子中免疫球蛋白超家族相結合,通過受體和配體的相互作用,調控著成纖維細胞的生理功能,其中對于膠原分泌的調控起著重要作用。

DDR2是一種酪氨酸激酶受體,以前的研究發現很多類型的酪氨酸激酶受體和整合素受體之間存在著協同作用,通過一系列信號轉導調節細胞的行為[16,26,27]。但是心肌成纖維細胞上的DDR2和整合素β1之間是否也存在著相互影響目前知之甚少,本研究發現,DDR2的表達降低可以削弱AngⅡ誘導的整合素β1的表達,顯然DDR2對于AngⅡ上調整合素β1的效應存在正向促進的作用。本研究還發現,對于沒有AngⅡ刺激的成纖維細胞,單純的DDR2高表達即能夠上調整合素β1的蛋白水平,顯示DDR2調控整合素β1是心肌成纖維細胞的一種基本信號轉導模式,而并非只存在于AngⅡ刺激的情況下。進一步的實驗結果發現,DDR2主要通過 Erk1/2信號,增強AngⅡ刺激后的心肌成纖維細胞的TGF-β1的表達,從而調控整合素β1。本研究表明,AngⅡ以DDR2為介導分子,通過激活Erk1/2-TGF-β1信號通路,調控心肌成纖維細胞中整合素β1的表達。

有研究發現DDR1對于整合素β1具有調控作用,從而影響腫瘤細胞的侵襲和上皮間質轉化。而本研究聚焦于DDR2而非DDR1,原因是DDR1主要表達于上皮細胞,而DDR2主要表達于間質類細胞例如心肌成纖維細胞。本研究揭示了DDR2能夠調控整合素β1表達的基本模式,闡明了AngⅡ通過DDR2-Erk1/2-TGF-β1調控整合素β1的信號轉導通路,為通過尋找新靶點拮抗心肌纖維化提供了重要依據。