三角帆蚌四個顏色選育系貝殼珍珠層顏色與外殼色的相關性分析

羅 雨，張文府，任 崗，程霄玲，方愛萍，葉容暉，張文娜，安顯博，張根芳*

(1.金華職業技術學院，浙江 金華 321017；2.金華市動物健康養殖高新技術研發中心，浙江 金華 321017；3.紹興文理學院，浙江 紹興 312000；4.金華水產技術推廣站，浙江 金華 321017；5.金華市威旺養殖新技術有限公司，浙江 金華 321017；6.東明縣馬頭鎮初級中學，山東 菏澤 274000；7.東明縣馬頭鎮中心學校，山東 菏澤 274000)

三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)是中國最主要的淡水珍珠育珠蚌，近十年來其平均年珍珠產量超過1 000 t。珍珠顏色是評價珍珠質量的一項重要指標，在自然狀態下，淡水珍珠顏色為深淺不一的紫色、粉色、金色、白色等多種色系[1]。據統計，中國淡水珍珠產量占全球總產量的90%以上，但銷售額不超過全球珍珠總銷售額的5%，其主要原因是中國90%以上的淡水珍珠顏色為雜色，白色、紫色等純色珍珠極為稀少。因此，迫切需要培育顏色純正、色澤均勻統一的淡水珍珠，以提高中國珍珠在國際市場上的競爭力。

前期研究表明，三角帆蚌貝殼珍珠層顏色受遺傳基因控制，屬質量性狀，可以穩定遺傳[2]。另外，海水珍珠和淡水珍珠均已被證明其珍珠的顏色與制片蚌珍珠層顏色保持一致，也都由制片蚌外套膜的分泌特性所決定[3-8]。因此，培育顏色均一的淡水珍珠需要選育具有特定貝殼珍珠層顏色的制片蚌。經過多年努力，已有紅色、藍色、金色和白色等4種珍珠層顏色選育系的制片蚌被培育出來。然而，在進行珍珠層顏色選育時，需要撬開三角帆蚌腹緣雙殼進行觀察，這不僅工作量大，而且容易導致蚌的損傷甚至死亡，對選育的進程和效果造成不利的影響。本團隊前期研究發現，可以通過觀察外殼色間接判斷珍珠層顏色，并證實了紫色和白色三角帆蚌外殼色與珍珠層顏色有一定的關聯性[9]。因此，本研究以選育的紅色、藍色、金色和白色三角帆蚌選育系為研究對象，進一步分析三角帆蚌珍珠層顏色參數與外殼顏色參數的相關性，同時通過方差分析、主成分分析對4個選育系之間珍珠層顏色、外殼顏色的差異進行分析并可視化，旨在為三角帆蚌珍珠層顏色性狀的間接選擇提供參考，以及為珍珠層顏色無損和高效選育提供理論基礎和實踐指導。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為金華市威旺養殖新技術有限公司養殖基地(國家級三角帆蚌良種場)的以珍珠層顏色為選育性狀并連續進行4代群體選育獲得的紅色、藍色、金色和白色三角帆蚌選育系。8～12月齡三角帆蚌殼長、殼寬、殼高等生長性狀處于平臺期[10]，該月齡段的蚌常被挑選作為制片蚌并開始插核手術以培育珍珠。同時，該階段的幼蚌貝殼已逐漸發育成為不透明狀態，外殼、珍珠層、棱柱層達2～3 mm，外殼色清晰。另外，一般情況下三角帆蚌在12月齡之前是養殖在加有營養泥的小網箱(40 cm×40 cm×12 cm)中，12月齡之后需要從小網箱中取出并分養至網袋中，導致外殼色因養殖環境的變化而發生改變。因此，本試驗選用蚌的規格為殼長7～8 cm的12月齡蚌。

1.2 試驗方法

1.2.1 取樣方法

分別隨機選取12月齡紅色、藍色、金色和白色三角帆蚌選育系(圖1)50只以上。清理蚌殼表面的污物后切斷三角帆蚌前后閉殼肌，去除內臟團及外套膜，清除蚌殼內表面的黏液，用清水洗凈后干燥，備測。干燥時避免陽光直射，以免對珍珠層顏色造成影響。

1.2.2 顏色測量方法

采用美國愛色麗ColorEye XTH色差儀(X.rite-Spectrophotometer)對珍珠層和外殼顏色數據進行測量，以獲取顏色參數L、a和b值(CIE1976)。 CIELab 顏色空間是利用 L、 a、 b三個不同的坐標軸，指示顏色在幾何坐標圖中的位置，其中 L軸表示明度，黑度在底端，白度在頂端；+a表示紅色，-a表示綠色；+b表示黃色，-b表示藍色。

1.2.3 測量位點的選取

培育珍珠的顏色與制片蚌珍珠層顏色保持一致。進行珍珠插片移植手術時，移植對象(組織小片)主要來源于制片蚌外套膜邊緣組織。另外，外套膜不同區域珍珠層顏色也有細微的差異[11]。因此，為盡量獲得整體外殼色代表性數據，外殼色的測量選取了前部、中部、后部和背部4個位點(圖2 a)；珍珠層顏色的測量選取距離腹緣0.8～1.2 cm處前部、中部和后部3個位點(圖2b)，測量位點盡量篩選表面色澤均勻且較光滑的區域，避開凹凸不平和瑕疵。

1.3 數據處理與分析

為了使數據更具有代表性，將每個蚌體珍珠層前部、中部和后部3個位點顏色參數的均值作為樣本珍珠層顏色的估計值，外殼前部、中部、后部和背部4個位點顏色參數的均值作為樣本外殼色的估計值。

采用IBM SPSS 21.0統計軟件對數據進行統計分析，計算珍珠層與外殼各顏色參數的Pearson相關系數，并對其進行顯著性檢驗(雙側)。以外殼各顏色參數作為自變量、珍珠層各顏色參數作為因變量，運用逐步回歸剔除偏回歸系數不顯著的顏色參數，建立珍珠層顏色對外殼各顏色參數的回歸方程；為了對四個選育系之間珍珠層顏色、外殼顏色差異進行可視化分析，利用主成分分析法分別提取3個珍珠層顏色參數、3個外殼顏色參數中無相關關系的2個主成分，并采用SYSTAT 13.0統計軟件進行作圖。

2 結果與分析

2.1 四個三角帆蚌選育系珍珠層與外殼各顏色參數的統計量及方差分析

對4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色參數的統計量見表1，由表中數據可知，白色選育系的L值最大，為72.79，說明白色選育系的珍珠層顏色亮度最好；與其他3個顏色選育系相比，白色選育系的a值和b值均較小，更加趨向于非彩色。金色選育系的b值最大，為8.45，b值越大表明顏色越趨向于金色，表明金色選育系珍珠層顏色最黃。紅色選育系的a值最大，a值越大表明顏色越趨向于紅色。藍色選育系的b值最大，b值越大表明顏色越趨向于藍色。

表1 四個三角帆蚌選育系珍珠層顏色參數的統計量Tab.1 Nacre color parameter statistics of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

對4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色參數進行方差分析，結果見表2。由表2可知，各顏色參數在不同選育系之間具有極顯著差異(P<0.01)。

表2 四個三角帆蚌選育系珍珠層顏色參數的方差分Tab.2 Analysis of variance of the nacre color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.2 四個三角帆蚌選育系珍珠層顏色的主成分分析

分別對4個三角帆蚌選育系珍珠層的3個顏色參數進行主成分分析，獲得了主成分1(PC1)和主成分2(PC2)。2個主成分的累積貢獻率為88.40%，貢獻率較高，說明其可解釋總變異的絕大部分，表明提取的2個主成分足以概括4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色的差異。圖3為4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色PC1和PC2的散布圖，可以看出，白色選育系與其他3個選育系的珍珠層顏色之間幾乎沒有重疊，表明白色選育系珍珠層顏色的量化數據與其他3個選育系之間差異較大。金色、紅色及藍色選育系三者之間均有重疊，其中金色與藍色選育系重疊區域最小，紅色與藍色選育系大部分重疊，表明金色與藍色選育系珍珠層顏色有一定的相似性，而紅色和藍色選育系珍珠層顏色相似性較高。

2.3 四個三角帆蚌選育系外殼色顏色參數的統計量及方差分析

對4個三角帆蚌選育系外殼色各顏色參數的統計量見表3，由表中數據可知，相對于珍珠層顏色，4個三角帆蚌選育系外殼色的L值較小，即其明亮度較低；a和b值均較大，表明4個三角帆蚌選育系外殼的顏色較為豐富。

表3 四個三角帆蚌選育系外殼顏色參數統計量Tab.3 Shell color parameter statistics of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

對4個三角帆蚌選育系外殼各顏色參數進行方差分析，結果見表4。由表4可知，外殼各顏色參數在不同選育系之間具有極顯著差異(P<0.01)。

表4 四個三角帆蚌選育系外殼顏色參數的方差分析Tab.4 Analysis of variance of the shell color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.4 四個三角帆蚌選育系外殼色的主成分分析

分別對4個三角帆蚌選育系外殼色的3個顏色參數進行主成分分析，獲得了PC1和PC2。2個主成分的累積貢獻率為93.93%，貢獻率較高，說明其可解釋總變異的絕大部分，表明提取的2個主成分足以概括4個三角帆蚌選育系外殼色的差異。4個三角帆蚌選育系外殼色PC1和PC2的散布如圖4所示，可以看出，4個三角帆蚌選育系外殼色皆有重疊，其中紅色與藍色選育系外殼色重疊度最高，說明二者外殼色較為相似；金色與白色選育系外殼色重疊度相對最低，表明二者外殼色差異在4種顏色選育系中相對容易被區分。

2.5 四個三角帆蚌選育系珍珠層顏色與外殼色的相關性分析

4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色與外殼色的相關性分析結果見表5。紅色選育系珍珠層顏色的L值與外殼色的L值極顯著相關(P<0.01)、a值顯著相關(P<0.05)，相關系數r分別為0.314和-0.268；珍珠層顏色的a值與外殼色的L值顯著相關(P<0.05)、a值及b值極顯著相關(P<0.01)，相關系數r分別為0.273、-0.502和-0.557；珍珠層顏色的b值與外殼色的b值極顯著相關(P<0.01)，相關系數r為-0.319。藍色選育系珍珠層顏色的L值和外殼色的L值與a值都極顯著相關(P<0.01)，相關系數r分別為0.533和-0.410；珍珠層顏色的a值與外殼色的L值及b值均極顯著相關(P<0.01)，相關系數r分別為0.419和-0.390；珍珠層顏色的b值與外殼色的L值顯著相關(P<0.05)，相關系數r為0.261。金色選育系珍珠層顏色a值、b值均與外殼色L值顯著相關(P<0.05)，相關系數r分別為0.331和0.335。白色選育系珍珠層顏色a值與外殼色a值極顯著相關(P<0.01)，相關系數r為0.286。

表5 四個三角帆蚌選育系珍珠層和外殼各顏色參數的相關性Tab.5 Correlation of color parameters of nacre and shell colors in the four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

2.6 四個三角帆蚌選育系珍珠層顏色和外殼色的回歸分析

運用逐步回歸分析法，以珍珠層顏色參數為因變量、外殼顏色參數為自變量，對4個三角帆蚌選育系珍珠層和外殼各顏色參數進行回歸分析(表6)。通過逐步回歸分析剔除不顯著的偏回歸系數，紅色選育系和藍色選育系珍珠層的3個顏色參數L、a和b皆與外殼顏色參數成功建立回歸方程；金色選育系只有珍珠層顏色參數 a和b與外殼顏色參數成功建立回歸方程；白色選育系珍珠層只有顏色參數 a與外殼顏色參數成功建立回歸方程。根據表6中數據，可以構建珍珠層顏色參數和外殼顏色參數間的回歸方程，例如紅色選育系珍珠層顏色參數(L-內、a-內、b-內)分別與外殼顏色參數(L-外、a-外、b-外)的回歸方程為：

表6 四個三角帆蚌選育系珍珠層和外殼各顏色參數的回歸分析Tab.6 Regression analysis of the nacre and shell color parameters of four selectively bred pearl mussel H.cumingii strains

L-內=55.734-1.048×a-外+0.870×b-外；

a-內=-1.767+0.338×L-外+0.182×a-外-0.470×b-外；

b-內=7.927-0.233×b-外。

3 討論

CIE Lab是國際通用的均勻顏色模型，因基于人眼生理特征并不受設備影響[12]，近年來被廣泛用于貝類外殼色和珍珠層顏色數據的定量測定[13-14]。本研究運用色差儀對紅色、藍色、金色和白色4個三角帆蚌選育系外殼和珍珠層顏色數據進行測量并量化，運用主成分分析法對不同三角帆蚌選育系外殼色和珍珠層顏色進行了對比，并分別對4個三角帆蚌選育系外殼和珍珠層各顏色參數的相關性進行了分析。

3.1 三角帆蚌不同選育系間珍珠層顏色、外殼色的差異性

主成分分析方法已經在水產領域得到了廣泛的應用[15-18]。本文運用主成分分析法對三角帆蚌不同選育系珍珠顏色、外殼色進行了主成分分析，結果表明，紅色、藍色、金色和白色4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色經過選育，已經基本上可以被相互區分開來，差異也較為明顯；4個三角帆蚌選育系的外殼色也具有差異，但是其差異沒有珍珠層顏色明顯。軟體動物貝殼分三層，最外層是由殼角蛋白構成的角質層，中間是由方解石構成的棱柱層，內層是由文石和蛋白質、幾丁質構成的珍珠層[19]。盡管這三層結構均主要由外套膜分泌形成，但由于角質層薄而且未礦化，因此其對應的外殼色更容易受到環境的影響。研究表明，多種海水貝類的貝殼顏色易受溫度、光照、食物等環境因素的調節[20]。本試驗中，對于珍珠層顏色，4個三角帆蚌選育系的外殼色相互重疊度更高，這可能是長期處于同一養殖水體導致的外殼色趨于同化。但值得注意的是，色差儀從4個三角帆蚌選育系外殼獲得的顏色數據并沒有像肉眼觀察到的能被明顯地區分，這可能是由于肉眼顏色評價是對外殼顏色性狀的整體評價，而色差儀所獲得的顏色數據是基于4個測量位點的，不能全面反映外殼顏色性狀。近年來，國內外已經開始對3D物體顏色測量進行探索[21-22]，若未來開發出針對多位點高通量或者物體3D顏色測量和分析的工具，則有利于貝類殼色的全面、整體評價。

3.2 三角帆蚌不同選育系珍珠層顏色與外殼色的相關性

三角帆蚌外殼和珍珠層各顏色參數相關分析結果表明，4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色與外殼色皆顯著相關，這與前期在三角帆蚌白色和紫色選育系中的研究結果[2]相似。在所有顏色相關數據中，紅色選育系中珍珠層顏色的a值與外殼色的b值相關性最強，相關系數r為-0.557。另外，紅色選育系中珍珠層顏色的a值與外殼色的a值呈現顯著的負相關(相關系數r為-0.502)。由于b 值代表藍黃軸上顏色的飽和度，正值表示黃色，b 值越大，則黃色色度越強；a 值代表綠紅軸上顏色的飽和度，正值表示紅色，a值越大，則紅色色度越強。因此，本研究結果表明，利用三角帆蚌外殼色挑選珍珠層紅色選育系時，應盡量剔除外殼呈現黃色系的個體。另外，該結果還暗示，若要通過外殼色間接篩選珍珠層呈明顯紅色的個體，則其外殼色的紅色色度不宜過深，即a值不宜過大。值得一提的是，在藍色、金色和白色三角帆蚌選育系中也都發現了類似于紅色選育系中對應和/或非對應顏色參數具有相關性的現象，例如藍色選育系中外殼色的L值與珍珠層顏色的L值和a值均顯著相關。基于CIE Lab顏色模型對海水珍珠貝的研究發現，外殼色和珍珠層顏色的相關性既存在于對應顏色參數，也存在于非對應顏色參數間[23]。這些結果表明，在CIE Lab顏色模型下，利用外殼色選育特定珍珠層顏色，既需要對應顏色參數的直接評價，也需要非對應顏色參數的間接篩選。

本研究還發現，相對于金色、白色選育系，紅色、藍色選育系珍珠層顏色與外殼色的相關性更強一些。有研究表明，在5～8月齡間，紫色三角帆蚌顏色參數a值和b值隨著月齡的增大，逐漸向a>0和b<0的方向發展，使紅色和藍色色度逐漸加深[24]。因此，推測以紫色選育系分離選育而來的紅色和藍色選育系利用外殼色間接評價珍珠層顏色的最佳時期應選擇在8月齡以后。本研究團隊發現，白色和金色2個淺色選育系在幼齡期的外殼色(白色和金色)受環境影響較小。考慮到三角帆蚌早期選擇對其生長性狀的顯著作用[25]，開展其珍珠層顏色和外殼色隨生長年齡變化的相關性研究，進而根據三角帆蚌不同時期的特點開展顏色、生長等不同性狀的分段式選擇，將有利于提高育種的效率。

3.3 存在問題與展望

本研究運用逐步回歸分析法，以珍珠層顏色參數為因變量、外殼顏色參數為自變量，分別對紅色、藍色、金色和白色4個三角帆蚌選育系珍珠層顏色與外殼色進行了回歸分析，建立了珍珠層顏色參數和外殼顏色參數的回歸方程，為三角帆蚌珍珠層顏色的間接選擇提供參考。但需要注意的是，并非所有的三角帆蚌珍珠層顏色參數和外殼顏色參數都具有相關性。因此，利用珍珠層顏色和外殼色的相關性進行珍珠層顏色選育時，可利用其相關性先對外殼色進行初步篩選，然后再對珍珠層顏色進行精準選擇，這樣既可以減少育種的工作量，又可以保證挑選的準確性。另外，探索和解析不同年齡階段貝殼顏色變化規律和成體貝殼色表型的關系，是進一步優化珍珠層顏色早期選育技術和培育高品質制片蚌的關鍵所在。