共培養誘導乳酸菌細菌素合成的研究進展

滿麗莉,向殿軍

(1.內蒙古民族大學 生命科學與食品學院,內蒙古 通遼 028042;2.內蒙古民族大學 農學院,內蒙古 通遼 028042)

國家衛生計生委辦公廳關于2015年全國食物中毒事件情況通報中顯示:28個省(自治區、直轄市)食物中毒事件169起,微生物性食物中毒人數最多,占全年食物中毒總人數的53.7%,主要致病因子為沙門氏菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌及其腸毒素、致瀉性大腸埃希氏菌等[1]。乳酸菌細菌素具有來源廣泛、安全性高、穩定性好、抑菌譜廣等眾多優點,作為一種新型的生物防腐劑、添加劑及生產輔助劑而備受青睞,乳酸菌及其細菌素被廣泛應用于乳及乳制品(酸乳、干酪)、肉及肉制品(冷鮮肉、香腸、肉干、肉粉腸、熟火腿)、果蔬及其發酵產品(泡菜、腌制白蘿卜、酸菜)、調味品(發酵香菇調味制品、酸奶味香精基料)、蛋制品、水產品中,有利于改善食品質量,延長貨架期,具有廣闊的應用前景[2-11]。乳酸菌細菌素的研究對提升食品安全具有重要意義,有利于抑制食品中常見致病性微生物引發的食物中毒和腐敗微生物引起的食品腐敗變質[12-17]。

與其他微生物一樣,乳酸菌在環境中無處不在,且所處的生存環境多為復雜的多種微生物共存,其生存及各種代謝活動(包括細菌素的合成)很可能依賴于復雜的種間交流和種內交流介導的集體行動,許多研究顯示,與特定革蘭氏陽性菌共培養可以誘導乳酸菌細菌素的合成,有利于解決目前乳酸菌細菌素由于合成量低而在食品中應用受限的問題,與其他提高乳酸菌細菌合成量的方法(發酵條件及發酵培養基優化、誘變育種、原生質體融合、基因工程)相比較,共培養提高細菌素的合成量具有時間短、設備利用率高、易于操作、成本相對較低等優點,但目前共培養誘導細菌素合成的潛在機制尚不完全明確,共培養誘導乳酸菌細菌素合成的工業應用需要掌握更多的相關理論依據和技術支持[18-23]。基于目前的研究結果,本文論述了共培養中誘導菌與乳酸菌細菌素合成的關系、誘導因子/信號分子的特征、雙組分調控系統及共培養誘導乳酸菌細菌素合成的分子機制,以期為實現共培養誘導乳酸菌細菌素合成的工業應用提供理論依據。

1 誘導菌與乳酸菌細菌素合成的關系

1.1 共培養對乳酸菌細菌素合成的影響

共培養對乳酸菌細菌素合成的影響主要體現在三個方面:第一,主要針對具有細菌素合成能力,但沒有抑菌活性的乳酸菌,共培養可誘導細菌素的合成,近而產生抑菌活性,例如:LactobacillusplantarumJ23、L.plantarumHE-1[24-25];第二,主要針對可合成細菌素并具有抑菌活性的乳酸菌,共培養可增加細菌素的合成量,例如:L.plantarum1.0391[26]、L.plantarumNMD-17[27]、L.paracaseiHD1.7[28];第三,共培養亦可抑制乳酸菌細菌素的合成,例如:兩株細菌素產生菌E.faecium6T1a與L.plantarumNC8C共培養后,細菌素的合成量均受到抑制[29],Piazentin等[30]的研究結果顯示,在與LigilactobacillussalivariusATTC 11742和LimosilactobacillusreuteriATCC 23272共培養時,E.faecium135的細菌素合成量受到抑制,可能是碳源競爭所導致的。

1.2 誘導菌與乳酸菌的親緣關系

誘導菌與細菌素合成乳酸菌可能是親緣關系較近,亦可能是親緣關系相當遠的菌株,如L.plantarumNC8既可與親緣關系較近的誘導菌E.faecalisEF1、E.faeciumLP6T1a-20、L.acidophilusNCDO1748、L.brevisLB9、L.bulgaricusATCC 11842、L.fermentumATCC 9338、L.sakeiNCFB 2714、Lactococcuslacticsubsp.cremorisCNRZ163、PediococcuspentosaceousFBB63共培養誘導細菌素的合成,亦可與親緣關系相對較遠的誘導菌BacilluscereusATCC 9139共培養誘導細菌素的合成[31]。L.plantarumHE-1與親緣關系較近的誘導菌L.fermentum、L.plantarum、Lactococcuslactic和親緣關系較遠的誘導菌Staphylococcusaureus和Bacillussubtilis共培養均可誘導細菌素的合成[25]。

1.3 誘導菌的特異性及抗性

乳酸菌細菌素合成的誘導菌具有特異性,大部分研究者都是將具備細菌素合成能力的乳酸菌與大量的革蘭氏陽性菌共培養,從中篩選出提高細菌素合成量的誘導菌,同時誘導菌對細菌素的抗性亦不相同。L.acidophilusLa-5與誘導菌StreptococcusthermophilusSTY-31、L.delbrueckiisubsp.bulgaricusCECT4005、L.delbrueckiisubsp.bulgaricusLBY-27、L.delbrueckiisubsp.lactisCECT282共培養能提高細菌素的合成,前兩株誘導菌對Lactacin B具有抗性,而后兩株誘導菌對其敏感[32]。L.paracaseiHD1-7與誘導菌B.subtilisATCC11774共培養能提高細菌素的合成,誘導菌對Paracin 1.7敏感[33]。LeuconostoccitreumGJ7與誘導菌L.plantarumKFRI464、L.delbrueckiiKFRI347、LeuconostocmesenteroidesKCTC1628共培養能提高細菌素的合成,誘導菌對Kimchicin G7敏感[34]。L.plantarumJ23與誘導菌L.hilgardiiJ81、L.lactisMG13363、P.pentosaceusFBB63共培養能提高細菌素的合成,L.hilgardiiJ81對L.plantarumJ23所產細菌素具有敏感性,而另兩株誘導菌具有抗性[24]。當L.plantarumDC400與誘導菌L.sanfranciscensisDPPMA174、Pediococcuspentosaceus2XA3共培養能提高細菌素的合成,誘導菌對Plantaricin A敏感[35]。

1.4 誘導菌對乳酸菌細菌素合成的影響

1.4.1 誘導菌的存在形式對乳酸菌細菌素合成的影響

大部分研究顯示一般活的或經溫和熱處理的誘導菌能夠誘導乳酸菌細菌素合成,也有少數研究發現誘導菌的發酵上清液或死菌菌懸液亦可發揮誘導作用。L.acidophilusLa-5、L.plantarumJ23與誘導菌的活菌、經溫和熱處理的菌體均能誘導細菌素的合成[32]。L.paracaseiHD1-7與誘導菌的活菌或發酵上清液共培養能提高細菌素的合成[33]。L.plantarumNC8與誘導菌的活菌、經溫和熱處理的菌體、上清液、死菌菌懸液共培養均能提高細菌素的合成。L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17只有與誘導菌的活菌共培養時才能誘導細菌素的合成,而誘導菌的上清液及死菌菌懸液無法誘導細菌素合成[36]。大部分研究結果顯示誘導菌的活菌均能誘導乳酸菌細菌素的合成,而發酵上清液或死菌菌懸液對乳酸菌細菌素是否有誘導作用表現不盡相同。

1.4.2 誘導菌對乳酸菌活菌數的影響

共培養后誘導菌會導致細菌素產生乳酸菌的數量呈現不同的變化,誘導菌L.helveticusKLDS1.9207、E.faeciumKLDS4.0352、L.reuteriKLDS1.0737、E.faecalisKLDS4.0313導致L.plantarumKLDS1.0391的活菌數顯著增加(P<0.01),L.plantarumNC8、L.plantarumNMD-17表現出一致的結果[37],而與L.plantarumDC400、L.acidophilusNCFM共培養的結果不同,誘導菌L.sanfranciscensisDPPMA174、L.rossiaeA7對L.plantarumDC400活菌數基本無影響(P>0.05),誘導菌L.monocytogenesEGD-e導致L.acidophilusNCFM的活菌數顯著降低。同時,L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17在與非誘導菌共培養時,其活菌數顯著下降(P<0.01),可從一定程度上說明L.plantarumKLDS1.0391和L.plantarumNMD-17細菌素合成量的增加與誘導菌所導致的活菌數增加存在一定的聯系[36],符合群體感應定義的密度依賴特征。

2 誘導因子/信號分子的特征

2.1 誘導因子/信號分子的分布及誘導活性

誘導因子/信號分子所處的位置會影響乳酸菌細菌素的合成。一般情況下,活的或經溫和熱處理的誘導菌能誘導乳酸菌細菌素的合成,而大部分誘導菌的上清液無法發揮誘導作用。經檢測發現誘導菌的無細胞上清液中缺少誘導活性可能有兩點原因:第一,可能是由于誘導因子/信號分子極少被運輸到細胞外,但也存在例外,當L.paracaseiHD1-7、L.plantarumNC8與誘導菌的活菌或上清液共培養后細胞外的誘導因子/信號分子活性增強[33];第二,可能與細胞外環境中AI-2的有效性有關,AI-2的有效性取決于AI-2合成微生物所處的生理狀態。高濃度的葡萄糖有利于AI-2在細胞外環境中的積累[37-39],但細胞外環境中的AI-2可能又會被微生物重新攝入細胞內,并作為對數生長期后期所需的碳源[40]。Moslehi-Jenabian等[41]研究發現,L.acidophilusNCFM發生酸休克會顯著增加胞外AI-2積累及luxS基因上調。Barefoot等和Tabasco等的研究發現,誘導因子/信號分子可能位于細胞質內或與誘導菌的細胞壁或細胞膜相結合,誘導因子/信號分子與誘導菌的細胞膜結合能顯著提高誘導因子的耐熱性,但當誘導因子/信號分子被分泌到細胞外時,熱處理會導致其誘導活性快速喪失[42]。

2.2 誘導因子/信號分子的誘導機制

2.2.1 通過物理接觸實現

誘導因子/信號分子可能以某種方式與細胞相結合,可存在于細胞壁、細胞膜或細胞質上,其轉移可通過與共培養菌的物理接觸來實現。原核生物中的Ⅳ和Ⅵ類型分泌系統需要細胞與細胞接觸來轉移大分子,此現象存在于部分革蘭氏陽性菌中[43-44],為通過細胞間接觸才能轉移誘導因子/信號分子提供合理的解釋,分泌到胞外的誘導因子/信號分子才可能作為某些細菌素合成相關基因的一種刺激。

2.2.2 通過誘導因子/信號分子的信息交流實現

共培養后誘導菌合成的誘導因子/信號分子仍具有誘導活性,可能是增加乳酸菌細菌素合成量的必要條件。例如,Di Cagno等[45]對L.plantarumDC400細菌素Plantaricin A合成的誘導研究證實了此解釋,將L.plantarumDC400與誘導菌的培養物置于兩個相連容器中,中間被滲透濾膜分隔開,避免兩者的物理接觸,但可進行分子間的信息交流,亦可誘導細菌素的合成。

2.2.3 通過受損修復實現

有研究顯示,部分輕度熱破壞的誘導菌仍可誘導乳酸菌細菌素的合成,原因可能有兩點:第一,可能在破壞的細胞碎片中存在未受損的誘導菌菌體;第二,可能是存在亞致死性損傷的誘導菌菌體,當與乳酸菌共培養后會重新處于富含營養的MRS或M17培養基中,亞致死性損傷的誘導菌菌體經修復后,恢復其正常的代謝活動及誘導因子/信號分子的合成、誘導能力。

2.3 誘導因子/信號分子AI-2的功能

誘導因子/信號分子AI-2與共培養誘導細菌素合成密切相關,共培養誘導乳酸菌細菌素合成過程中,AI-2濃度與細菌素的合成量具有同步性,然而,AI-2與細菌素合成之間的直接聯系尚未完全建立。luxS基因編碼的蛋白是參與AI-2合成的關鍵酶,luxS基因在不同種屬的微生物中具有相對高度的保守性,AI-2通常被認為是不同菌株之間交流的種群間信號分子。例如:與特定的革蘭氏陽性菌活菌共培養6～9 h能顯著增加L.plantarumKLDS1.0391的細菌素合成量,細菌素的合成量與L.plantarumKLDS1.0391的菌體密度、AI-2濃度呈現正相關性,luxS基因缺失突變菌株共培養后不能誘導細菌素合成量增加,可能原因在于luxS基因缺失突變菌株與誘導菌共培養后,AI-2的濃度未能達到閾值,信號分子無法被識別。AI-2的誘導活性通常見于厚壁菌,如植物乳桿菌[46-47],但乳酸菌屬對AI-2的信號輸出和接收/轉導途徑尚未完全明晰,在其他微生物中發現了AI-2的特異性受體,包括LuxP家族、LsrB家族及rbsB基因編碼的核糖ABC轉運蛋白[48-51]。

共培養中,乳酸菌中AI-2受體對通過群體感應系統誘導Ⅱ類細菌素合成中是必需的。L.plantarumC11、L.plantarumNC8與同一誘導菌L.lactisIL1403共培養均能誘導細菌素的合成,但作為信號分子AI-2受體的組氨酸激酶的結合序列具有顯著差異,說明在L.plantarumC11和L.plantarumNC8中可能存在另一共有的AI-2受體,此受體可能是由rbsB基因編碼的,因為rbsB基因在許多微生物中廣泛存在,并具有作為AI-2受體的潛在功能,從理論上可補充該受體誘導或輔助AI-2依賴型細菌素調控的能力,但還需進一步驗證[52]。

3 雙組分調控系統

國內外研究顯示,與特定乳酸菌共培養誘導細菌素的合成受到群體感應(quorum sensing,QS)系統的調控,QS系統主要包括信號分子和雙組分調控系統(TCS)[53-55]。典型的雙組分調控系統(TCS)包括位于細胞質膜的組氨酸蛋白激酶(HPK)和位于細胞質中的反應調節蛋白(RR)兩部分。HPK作為感受器,能監測環境變化(如共培養菌株的存在),RR具有傳遞來自感受器的信號和調節基因表達的作用, 可同時調節一個調節子中多個基因的表達[56]。

Lactococcuslactis合成的細菌素Nisin是研究最透徹且已經實現商業化生產的細菌素,Nisin合成是受雙組分調控系統Nis K(HPK)和Nis R(RR)所調控的,當兩者被破壞時,細菌素將無法正常合成[57]。L.paracaseiHD1.7 合成的細菌素Paracin 1.7受Prc K(HPK)和Prc R(RR)的調控,當與枯草芽孢桿菌ATCC 11774共培養時,L.paracaseiHD1.7所產細菌素為其單獨培養的 1.21 倍,群體感應相關基因prcK和prcR分別上調4.98倍及5.41倍。L.plantarum中與細菌素合成相關的雙組分調控系統主要包括三類:第一類是L.plantarumC11、WCFS1、J51、V90、ATCC14917、BFE5092、YM-4-3、ST-Ⅲ、ZJ316中的PlnB(HPK)和PlnC(RR)、PlnD(RR),PlnC能激活轉錄并合成細菌素,而PlnD發揮負調節作用;第二類是L.plantarumJDM1和L.plantarumNMD-17中的PlnB(HPK)和PlnD(RR),而不存在PlnC;第三類是L.plantarumNC8、J23、LZ206、PCS20、UL4、163、KLDS1.0391中的PlNC8HK(HPK)和PlnD(RR)[58-59]。LactobacillussakeiLb706 合成的細菌素Sakacin A受Sap K(HPK)和Sap R(RR)的調控;CarnobacteriumpiscicolaLV17B合成的細菌素Carnobacteriocin B2和Carnobacteriocin BM1受Cbn K(HPK)和Cbn R(RR)的調控;Streptococcussalivarius合成的細菌素salivaricin A受SalK(HPK)和SalR(RR)的調控[60-61]。掌握乳酸菌中與細菌素合成相關的雙組分調控系統類型,明確雙組分調控系統在乳酸菌細菌素合成中作用,有助于更好地提高細菌素的合成量。

4 共培養誘導乳酸菌細菌素合成的分子機制

4.1 自體誘導機制

共培養誘導L.plantarumNC8細菌素的合成與自體誘導機制密切相關,自體誘導機制需要通過誘導因子plNC8IF、組氨酸蛋白激酶plNC8HK和反應調節蛋白plnD的群體感應調控系統實現[62-63]。L.plantarumC11與L.plantarumNC8中的群體感應調控系統在功能上展現出一定的相似性,其調控系統由細菌素/誘導肽plnA、組氨酸蛋白激酶plnB和兩個反應調節蛋白plnC及plnD構成。共培養能同時使L.plantarumNC8中細菌素編碼的結構基因plNC8βα及調控系統編碼基因發生上調[64-65]。L.plantarumNC8中群體感應調控系統編碼基因被敲除,誘導菌的加入將無法誘導突變株細菌素的合成,說明群體感應調控系統是共培養誘導細菌素合成的必要部分。組氨酸蛋白激酶具有N端跨膜結構域,可感知胞外誘導因子的存在,通過磷酸化反應將信號傳遞給反應調節蛋白,反應調節蛋白結合到細菌素合成相關基因上,近而誘導其表達。同一誘導菌可同時提高L.plantarumNC8和L.plantarumWCFS1的細菌素合成,但兩者的組氨酸蛋白激酶序列具有較低的同源性,誘導菌合成的誘導因子無法同時被兩種組氨酸蛋白激酶所感知,可能是由于誘導菌可同時產生兩種不同的誘導因子,或者乳酸菌中還存在組氨酸蛋白激酶以外的分子作為信號接收器,調控特定的反應調節蛋白,從而激活細菌素合成調控操縱子[52]。

4.2 二級調控機制

L.acidophilusLa-5單獨培養時僅能在固體培養基中產生細菌素,而在液體培養基中不能產生細菌素,當與誘導菌共培養時亦可在液體培養基中產生細菌素。L.acidophilusLa-5的細菌素Lactacin B合成可能是由群體感應調控系統和自身啟動子(二級調控機制)共同完成的[66]。L.acidophilusLa-5與人工合成的誘導因子IP_1800共培養時發現其細菌素合成是一個劑量依賴的調控過程,誘導因子的添加導致細菌素結構基因lbaB在轉錄水平上上調,細菌素的合成量增加,表明群體感應系統是細菌素Lactacin B合成的調控機制之一。而L.acidophilusLa-5與誘導菌S.thermophilusSTY-31共培養導致結構基因lbaB、自體誘導因子IP_1800編碼基因及ABC轉運蛋白編碼基因ABC_1796在轉錄水平上顯著上調,結構基因lbaB的上調程度明顯高于細菌素Lactacin B合成相關的其他基因,細菌素的合成量增加。轉錄分析表明細菌素Lactacin B合成相關基因應轉錄為同一轉錄本,但這與誘導菌共培養后結構基因上調程度顯著高于其他細菌素合成相關基因存在矛盾,根據上述結果推測細菌素結構基因lbaB另外還受自身啟動子的調控(二級調控機制),位于細菌素Lactacin B操縱子下游的內在終止子被認為是潛在的lbaB調節因子。因此,共培養的誘導菌可能被L.acidophilusLa-5認為是一種外界刺激,通過其初級或次級代謝產物的產生或與乳酸菌的物理接觸,從而激活推測的二級調控機制[32]。

4.3 不同信號分子的聯合調控機制

L.plantarumDC400與特定誘導菌L.sanfranciscensisDPPMA174、P.pentosaceus2XA3共培養能顯著增加細菌素的合成量,但L.plantarumDC400的生長量和存活率卻未受到影響,此過程中L.plantarumDC400產生的細菌素Plantaricin A亦是信號分子,同時L.plantarumDC400中luxS基因的表達量顯著上調,運用V.harveyiBB170菌株檢測發現共培養后的上清液中信號分子AI-2活性增加,說明共培養對細菌素的誘導作用可能同時受到Plantaricin A和AI-2兩種信號分子的調控[45]。

5 結論

乳酸菌細菌素作為天然的功能性防腐劑具有安全、環保、無毒、抑菌譜寬、穩定性強等優點,在食品、調味品中展現出較好的開發前景,新技術、新方法的不斷發展和研究給乳酸菌細菌素在食品領域中的應用帶來新的機遇[67-69]。乳酸菌與其他菌株共存是在自然環境和發酵食品中常見的現象,大量研究顯示與革蘭氏陽性菌共培養能誘導乳酸菌的細菌素合成,但由于乳酸菌細菌素合成涉及的合成基因和調控基因、途徑的多樣性和復雜性等,誘導機理尚未完全清晰。共培養誘導細菌素合成是復雜的生物之間相互作用的過程,要實現其工業化應用需要進一步明確潛在信號分子的鑒定及合成途徑、信號分子的接收部位、信號分子的傳遞途徑、細菌素合成相關基因的啟動方式、共培養過程中相關基因和蛋白質的轉錄和表達情況、乳酸菌感知其他微生物存在的方式等諸多問題,應用轉錄組學、蛋白組學和代謝組學有利于掌握共培養條件下基因、蛋白質表達的整體變化和代謝途徑等,有助于識別差異表達的基因和蛋白質,從中挖掘有價值的信息。科學技術的不斷發展有助于更加全面和深入地揭示共培養誘導細菌素合成的調控機制,滿足消費者對高質量食品的安全性要求。